甲基苯丙胺(Methamphtemine,METH)具有成瘾性强、易于人工合成等特点,在全球范围的广泛流行和滥用,给人类健康和社会治安带来严重威胁。METH可引起海马、杏仁核、纹状体、前额叶皮质等多个脑区神经细胞的损伤。短时间大剂接触或者长期吸食METH可能导致神经精神障碍和认知功能损害相关疾病,比如专注力下降,学习记忆损伤,诱发抑郁、帕金森病、阿尔兹海默症等。很多研究表明,海马神经元的损伤在上述疾病发生发展过程中发挥着重要作用。氧化应激、线粒体损伤、内质网应激是METH产生神经毒性作用的重要病理机制。焦亡是近年来发现的一种程序性细胞死亡机制,其执行蛋白为消皮素(Gasdermins,GSDMs)蛋白家族。目前GSDMD和GSDME蛋白的损伤机制最为明晰。Caspase-1和casapse-11识别剪切GSDMD,产生cleavedGSDMD-NT;caspase-3识别剪切GSDME,产生cleaved-GSDME-NT。活化的cleaved-GSDMD-NT和cleaved-GSDME-NT可发生寡聚化,并结合于细胞膜的磷脂质,造成细胞膜微孔形成,导致细胞内容物外泄、细胞肿胀和细胞死亡。METH是否可通过焦亡引起海马神经元损伤尚未见报道。内质网(Endoplasmic reticulum,ER)是细胞内负责蛋白质的合成、折叠和转运的膜性细胞器。蛋白质正常折叠受阻或发生错误折叠会导致异常蛋白质在细胞内的积聚,进而激活未折叠蛋白反应导致内质网应激发生。在应激情况下,内质网膜上的三种内质网应激感应蛋白:肌醇需求酶1α(Inositol-requiring protein 1α,IRE1α)、RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PKR-like eukaryotic initiation factor 2αkinase,PERK)和转录激活因子6(Activating transcription factor 6,ATF6)与分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(Glucose regulated protein 78,GRP78)分离而活化,并引起一系列分子反应。研究表明内质网应激在炎症、凋亡以及自噬等多种病理损伤中发挥作用。但内质网应激是否参与焦亡发生目前尚未见报道。哺乳动物脑中枢神经系统存在大量胶质细胞,主要由星形胶质细胞和小胶质细胞构成。星形胶质细胞还可和血管内皮细胞相耦合,构成血脑屏障。星形胶质细胞和小胶质细胞在维持大脑内环境的稳态方面发挥重要作用。研究表明METH可诱导星形胶质细胞和小胶质细胞活化,并对神经元产生损伤作用。那么,METH处理星形胶质细胞和小胶质细胞后,是否可触发神经元发生焦亡,也是本文关注的焦点。基于以上的研究背景,我们从以下三个方面开展研究:1)探讨METH处理是否可引起海马神经元发生焦亡;2)探讨内质网应激机制是否参与METH诱导的海马神经元焦亡发生;3)探讨METH激活星形胶质细胞和小胶质细胞是否可触发海马神经元发生焦亡。为METH的神经毒性机制提供新的理论和实验依据。第一部分焦亡在甲基苯丙胺致海马神经元损伤中的作用研究目的:探讨焦亡在甲基苯丙胺致海马神经元损伤中的作用。方法:将7-8周C57BL/6J小鼠12只随机分为对照组和METH处理组。METH处理组小鼠腹腔注射METH(15mg/kg,间隔12 h,共给药8次)。对照组同时注射0.9%生理盐水。在第一次给药时进行神经刻板行为评价和肛温测量。最后一次给药6 h后,提取小鼠脑组织。每组3只用于制作石蜡切片,通过硫堇染色观察海马CA1区和CA3区神经元损伤情况,通过免疫组织化学染色观察海马CA3区神经元GSDMD和GSDME蛋白表达情况。其余组脑组织通过Western blot检测海马区GSDMD、GSDME和cleaved-GSDME-NT蛋白表达情况。培养小鼠海马神经元细胞系HT-22细胞。通过免疫荧光染色观察MAP2蛋白表达情况。通过免疫组织化学染色观察GSDMD、GSDME蛋白表达情况,并用Western blot进行验证。用不同METH浓度(0,0.25m M,0.5 m M,1.0 m M,2.0 m M)处理HT-22细胞24 h进行浓度依赖性检测,用1.0 m M METH以不同时间(1 h,3 h,6 h,12 h,24 h)处理HT-22细胞进行时间依赖性检测,并通过Western blot检测cleaved-GSDME-NT蛋白、LDH浓度检测和SYTOX acid green染色分析HT-22细胞焦亡情况。通过si GSDME敲低HT-22细胞GSDME蛋白的表达,进一步验证GSDME蛋白在METH诱导HT-22细胞损伤中的作用。结果:1.C57BL/6J小鼠经METH处理后,可产生神经刻板行为及高热,结果表明METH具有神经毒性作用。2.经METH处理后,小鼠海马CA1和CA3区发生神经元变性死亡。3.焦亡相关蛋白检测显示海马神经元表达GSDME蛋白,但无GSDMD蛋白表达。4.经METH处理后,海马CA3区神经元GSDME阳性细胞数目增加,cleaved-GSDME-NT蛋白表达升高,提示METH可致海马神经元发生焦亡。5.METH处理HT-22细胞,cleaved-GSDME-NT蛋白表达水平、LDH浓度以及SYTOX acid green阳性细胞数目增加。通过si GSDME敲低GSDME蛋白则可拮抗相应指标的增加,结果表明METH可诱导HT-22细胞发生GSDME相关焦亡。小结:METH可以诱导海马神经元发生损伤,该损伤与GSDME介导的焦亡密切相关。第二部分甲基苯丙胺诱导海马神经元焦亡损伤的内质网应激机制研究目的:观察METH对海马神经元内质网应激相关蛋白表达的影响,并探讨不同内质网应激途径在METH诱导海马神经元焦亡发生中的作用。方法:将7-8周C57BL/6J小鼠24只随机分为对照组、METH处理组、METH+TUDCA处理组和TUDCA处理组。METH处理组小鼠腹腔注射METH(15mg/kg,间隔12 h,共给药8次)。对照组同时注射0.9%生理盐水。METH+TUDCA处理组在给与METH前6h,腹腔注射给与TUDCA(250 mg/kg)。TUDCA处理组同时腹腔注射给与TUDCA(250mg/kg)。最后一次给药6 h后,提取小鼠脑组织。每组3只用于制作石蜡切片,通过硫堇染色观察海马CA3区神经元损伤情况,通过免疫组织化学染色观察海马CA3区神经元GSDME蛋白表达情况。其余组脑组织通过Western blot检测海马区GRP78和cleaved-GSDME-NT蛋白表达情况。培养小鼠海马神经元系HT-22细胞。用不同METH浓度(0,0.25 m M,0.5 m M,1.0 m M,2.0 m M)处理HT-22细胞24 h,或用1.0 m M METH以不同时间(1 h,3 h,6 h,12 h,24 h)处理HT-22细胞,并通过Western blot检测GRP78、IRE1α\p-IRE1α、PERK\p-PERK、ATF6蛋白的表达情况。用多种内质网应激化学抑制剂(TUDCA,200μM;STF-083010,50μM;GSK-2656157,500n M)和si RNAs(si Caspase-3,si TRAF2;si ATF6)处理HT-22细胞,通过相应通路蛋白和cleaved-GSDME-NT蛋白的Western blot检测、LDH浓度检测和SYTOX acid green染色分析HT-22细胞焦亡情况。结果:1.METH可增加小鼠海马神经元GRP78蛋白表达,提示METH可诱导海马神经元发生内质网应激。2.小鼠给予内质网应激抑制剂TUDCA后,明显抑制了METH所致海马CA3区神经元的变性死亡、GSDME阳性细胞增加,以及GRP78和cleaved-GSDME-NT蛋白表达增加。HT-22细胞经TUDCA处理后,也明显抑制了METH所引起的GRP78蛋白、cleaved-GSDME-NT蛋白、LDH浓度以及SYTOX acid green阳性细胞数的增加,表明内质网应激参与了METH所致海马神经元的焦亡损伤。3.HT-22细胞经TUDCA处理后,明显抑制了METH引起的cleaved-caspase-3蛋白表达增加。通过si Caspase-3敲低caspase-3蛋白,可拮抗METH所致cleaved-GSDME-NT蛋白、LDH浓度以及SYTOX green acid阳性细胞数的相应指标的增加,提示METH导致的内质网应激可通过caspase-3介导GSDME相关焦亡的发生。4.METH可引起HT-22细胞IRE1α/p-IRE1α蛋白表达增加。用STF-083010抑制IRE1α核酸内切酶活性,用si TRAF2抑制IRE1α蛋白酶活性都可拮抗METH引起的XBP-1s、TRAF2、CHOP、cleaved-caspase-3、cleaved-GSDME-NT蛋白、LDH浓度以及SYTOX green acid阳性细胞数的增加,表明IRE1α途径参与METH诱导的海马神经元焦亡。5.METH可增加HT-22细胞PERK/p-PERK蛋白表达。用GSK-2656157抑制PERK通路e IF2α蛋白的磷酸化活性,可拮抗METH引起的p-e IF2α、ATF4、CHOP、cleaved-caspase-3、cleaved-GSDME-NT蛋白、LDH浓度以及SYTOX green acid阳性细胞数的增加,表明PERK途径参与METH诱导的海马神经元焦亡。6.METH处理HT-22细胞可引起ATF6蛋白表达增加。用si ATF6抑制ATF6的表达,可拮抗METH引起的ATF6、CHOP、cleaved-caspase-3、cleaved-GSDME-NT蛋白、LDH检测浓度以及SYTOX acid green阳性细胞数目的增加。结果表明ATF6途径参与METH诱导海马神经元的焦亡。小结:METH诱导海马神经元内质网应激通路的活化;内质网应激的IRE1α、PERK、ATF6三条分支通路均参与了METH诱导的海马神经元焦亡发生;Caspase-3是内质网应激与海马神经元焦亡进行对话的重要因子。第三部分甲基苯丙胺诱导胶质细胞活化在海马神经元发生焦亡中的作用研究目的:在METH活化星形胶质细胞和小胶质细胞后,将得到的条件培养基处理海马神经元,明确METH是否可通过星形胶质细胞和小胶质细胞活化,触发海马神经元发生焦亡。方法:将7-8周C57BL/6J小鼠6只随机分为对照组和METH处理组。METH处理组小鼠腹腔注射METH(15mg/kg,间隔12 h,共给药8次)。对照组同时注射0.9%生理盐水。最后一次给药6 h后,提取小鼠脑组织。每组3只用于制作石蜡切片,通过免疫组织化学染色观察海马区星形胶质细胞GFAP和小胶质细胞Iba-1蛋白的表达活化情况,通过免疫荧光染色观察星形胶质细胞AQP4蛋白的表达情况。培养小鼠星形胶质细胞系C8D1A细胞和小胶质细胞系N9细胞。通过免疫荧光染色观察GFAP和Iba-1蛋白表达变化。用1.0 m M METH以不同时间(1 h,3 h,6 h,12 h,24 h)处理C8D1A细胞和N9细胞,并用超高效液相色谱质-高分辨谱联用分析(UPLC-HRMS)检测培养基中METH浓度变化。C8D1A细胞分为2组,METH-组,和METH+组。METH+组用1.0 m M METH处理24 h,METH-组同时给与等量1×PBS处理,获得C8D1A条件培养基。N9细胞给予相同处理。培养小鼠海马神经元系HT-22细胞。将得到的胶质细胞条件培养基与新鲜培养基按1:1混匀,并平衡不同条件培养基中METH浓度,将配制好的培养基处理HT-22细胞。通过Western blot检测cleaved-caspase-3和cleaved-GSDME-NT蛋白、LDH浓度检测和SYTOX acid green染色分析HT-22细胞焦亡情况。结果:1.METH处理后,小鼠海马区星形胶质细胞、小胶质细胞GFAP、Iba-1表达增加,胞体增大,突起增多,表明METH诱导了星形胶质细胞和小胶质细胞活化。2.METH处理后,海马区星形胶质细胞AQP4表达升高,进一步表明METH对星形胶质细胞的损伤作用。3.荧光显微镜下观察到C8D1A细胞呈GFAP阳性,具有星形胶质细胞表达特征;N9细胞呈Iba-1阳性,具有小胶质细胞特征,可用于后续研究。4.UPLC-HRMS分析结果表明METH处理C8D1A细胞和N9细胞,培养基中METH浓度不随处理时间变化而改变,为后续实验METH给药提供了依据。5.METH处理C8D1A细胞和N9细胞得到的条件培养基可诱导HT-22细胞cleaved-caspase-3、cleaved-GSDME-NT蛋白、LDH浓度以及SYTOX acid green阳性细胞数的增加,表明METH诱导胶质细胞活化可引起海马神经元发生焦亡。小结:METH可诱导星形胶质细胞和小胶质细胞活化;胶质细胞活化可诱导海马神经元发生GSDME蛋白相关焦亡。首次证实METH所致星形胶质细胞和小胶质细胞的异常活化可诱导海马神经元发生焦亡,为胶质细胞的活化伤神经元提供了新的实验依据。结论:1.焦亡在METH诱导的海马神经元损伤中发挥重要作用,且该过程主要由焦亡执行蛋白消皮素GSDME介导。2.与内质网应激相关IRE1α、PERK、ATF6三条通路均参与了METH诱导的海马神经元焦亡发生。3.METH可通过触发星形胶质细胞和小胶质细胞活化诱导海马神经元焦亡发生。