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糖尿病是由遗传和环境因素相互作用而引起的严重危害人类健康和生命的内分泌代谢性疾病。随着社会经济的发展、人口老龄化以及人们生活方式的改变,糖尿病的发病率在全球范围内呈逐年增高的趋势,目前已增至3.47亿。我国是世界上糖尿病患者最多的三个国家之一,目前糖尿病人口至少9240万,占全球总糖尿病人口的四分之一,其中90%以上为2型糖尿病(Type2diabetes mellitus, T2DM)患者。T2DM现已成为继心血管病和肿瘤之后,第3位严重威胁人类健康和生命的非传染性疾病。因此,研究其发病机制和寻找其有效治疗药物具有十分重要的临床意义。黄芪多糖(Astragalus polysaccharide, APS)是从豆科植物膜荚黄芪或蒙古黄比的干燥根中提取的水溶性多糖成分。本课题组前期的实验结果表明：APS能有效的降低T2DM动物模型的血糖水平并改善其胰岛素抵抗的状态。APS降低血糖水平的机制与激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)有关,但其中的具体机制尚未完全明了。本研究以L6大鼠成肌细胞为靶细胞,证明了APS能够促进细胞的葡萄糖摄取,并探讨了APS活化AMPK的机制以及APS对AMPK下游信号通路途径的作用,进一步阐明了APS降低血糖水平的机制。研究分为以下二个部分。第一部分黄芪多糖对腺苷酸活化蛋白激酶的激活作用及其机制的实验研究目的：由于腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的激活能刺激骨骼肌细胞的葡萄糖摄取,AMPK被认为是治疗2型糖尿病(T2DM)的潜在靶点。黄芪多糖(APS)是中药黄芪的主要活性物质之一。在前期的实验研究中,我们发现在T2DM动物模型的骨骼肌组织,APS可以提高其AMPK的活性,从而减轻T2DM的“糖毒性”。在本研究中,我们试图以L6大鼠成肌细胞为靶细胞,观察APS对AMPK的活化作用并阐明其机制。方法：(1)采用MTT法检测不同浓度的APS对L6细胞的细胞毒性；(2)用400μg/mL的APS处理L6细胞24h,采用Western blot analysis方法检测p-AMPK (Thr172)、AMPK、p-ACC (Ser79)和ACC的表达,并计算p-AMPK/AMPK和p-ACC/ACC比值；(3)用400μg/mL的APS处理L6细胞24h,SAMS肽法检测AMPK活性；(4)分别用APS (400μg/mL作用24h)、罗格列酮(200μmol/L作用30min)和二甲双胍(2mmol/L作用3h)处理L6细胞,以罗格列酮作为阳性对照,以二甲双胍作为阴性对照,用冷高氯酸(HC1O4)提取L6细胞内腺嘌呤核苷酸,并用高效液相色谱(HPLC)法检测L6细胞内AMP, ADP和ATP含量,计算AMP:ATP和ADP:ATP比值；(5)培养L6细胞和HeLa细胞(缺乏肿瘤抑制因子LKB1基因),分别给予Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶β(CaMKKβ)选择性抑制剂STO-609预孵育(10μg/mL作用1h),然后分别用APS (400μg/mL作用24h)、伊屋诺霉素(1μmol/L作用30min)和AICAR (0.5mmol/L作用30min)处理细胞,采用Western blot analysis方法检测p-AMPK (Thrl72)、AMPK、p-ACC(Ser79)和ACC的表达,并计算p-AMPK/AMPK(?)p-ACC/ACC比值。结果：(1)不同浓度APS(100,200,400,800和1600μg/mL)对L6细胞无明显的细胞毒性,各浓度APS处理组与对照组之间细胞增殖率无明显差异；(2)APS处理组p-AMPK (Thr172)和p-ACC (Ser79)表达、p-AMPK/AMPK和p-ACC/ACC比值以及AMPK活性均高于对照组；(3)APS能明显提高L6细胞内AMP浓度以及AMP:ATP比值；(4)APS能显著提高L6细胞和HeLa细胞p-AMPK (Thr172)和p-ACC (Ser79)表达以及p-AMPK/AMPK和p-ACC/ACC比值,STO-609预处理L6细胞并未降低APS提高的AMPK和ACC的磷酸化水平,但STO-609预处理却明显降低了APS促进的HeLa细胞p-AMPK (Thr172)和p-ACC (Ser79)的表达。结论：(1)APS可以活化AMPK;(2)APS能提高细胞内AMP浓度以及AMP:ATP比值；(3)APS可以通过LKB1,也可以通过CaMKKβ活化AMPK。第二部分黄芪多糖促进L6细胞葡萄糖摄取的作用及其对AS160磷酸化的影响目的：160kDa的Akt底物(AS160)被认为是联系骨骼肌腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路途径与葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)转位以及后续葡萄糖摄取的关键分子。作为中药黄芪主要活性物质之一的黄芪多糖(APS),近期被发现可以通过提高骨骼肌细胞AMPK活性而刺激其葡萄糖摄取。本研究试图以L6大鼠成肌细胞为靶细胞,观察APS对细胞葡萄糖摄取的刺激作用,进一步探讨APS刺激的葡萄糖摄取是否是通过AS160介导的。方法：(1)培养L6细胞,分别给予400μg/mL APS处理不同的时间(6～48h)以及不同浓度APS(100～1600μg/mL)处理24h,2-脱氧-[3H]-D-葡萄糖法检测细胞的葡萄糖摄取：(2)培养L6细胞,分别给予AMPK抑制齐Compound C (1μmol/L作用30min)和Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶p (CaMKKβ)选择性抑制(?)STO-609(10μg/mL作用1h)预孵育,然后用400μg/mL勺APS作用24h,2-脱氧-[3H]-D-葡萄糖法检测细胞的葡萄糖摄取；(3)400μg/mL的APS处理L6细胞24h,采用Western blot analysis方法检测p-AS160和AS160的表达,并计算p-AS160/AS160比值；(4)采用大肠杆菌TOP10感受态细胞进行野生型AS160(AS160-WT)质粒和4P突变型AS160(AS160-4P)质粒的扩增,采用无内毒素质粒中提试剂盒抽提纯化质粒,并采用高通量DNA测序服务进行重组质粒的DNA序列分析；(5)在L6细胞中分别瞬时转染AS160-WT和AS160-4P质粒以及空载体pCAGGS,采用Western blot analysis方法检测转染各组AS160和Myc-Tag的表达；(6)400μg/mL的APS处理分别转染AS160-WT和AS160-4P质粒的L6细胞24h,2-脱氧-[3H]-D-葡萄糖法检测细胞的葡萄糖摄取；(7)培养L6细胞,给予Compound C(1μmol/L)预孵育30min,然后分别用APS(400μg/mL作用24h)、胰岛素(1μmol/L作用30min)和AICAR (0.5mmol/L作用30min)处理细胞,采用Western blot analysis方法检(?)p-AMPK (Thr172)、AMPK、p-ACC (Ser79)、 ACC、p-AS160和AS160的表达,并计算p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC和p-AS160/AS160比值。结果：(1)APS呈时间和浓度依赖性的刺激L6细胞的葡萄糖摄取；(2)Compound C可以降低APS刺激L6细胞葡萄糖摄取的作用,但STO-609对APS刺激L6细胞葡萄糖摄取的作用不影响；(3)APS可以明显提高L6细胞p-AS160表达和p-AS160/AS160比值；(4)AS160-4P质粒点突变位置正确,即：4个Akt磷酸化位点(Ser318, Ser588, Thr642和Ser751)被突变成丙氨酸；(5)转染AS160-WT和AS160-4P质粒组可以检测到Myc-Tag标签蛋白的表达,且AS160的表达明显高于转染pCAGGS空载体组；(6)转染AS160-4P质粒组与转染AS160-WT质粒组比较,其APS对L6细胞葡萄糖摄取的刺激作用明显降低；(7) Compound C预处理L6细胞明显降低了APS提高的AMPK、ACC和AS160的磷酸化水平。结论：(1)APS可以通过活化AMPK刺激L6细胞的葡萄糖摄取；(2)APS可以通过提高AS160的磷酸化水平刺激L6细胞的葡萄糖摄取；(3)APS促进AS160磷酸化是依赖AMPK的。