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研究表明,低温环境可导致精子蛋白酪氨酸磷酸化并使其被动获能,缩短其冻后存活时间。Genistein是一种天然异黄酮化合物,可通过抑制酪氨酸蛋白激酶活性降低细胞内蛋白酪氨酸磷酸化,发挥抗癌作用,但是其作为精子获能阻断剂的报道却很少。试验拟通过在猪精液冷冻稀释液中添加Genistein,降低冻融精子蛋白酪氨酸磷酸化以减少“获能样”精子的出现,从而进一步提高冻后精子的质量,为突破冷冻猪精子人工授精后繁殖成绩不理想的技术瓶颈奠定科学依据和理论基础。具体研究内容及结果如下:1.Genistein对猪精子冻后表观指标的影响。在猪精子冷冻稀释液中添加不同浓度（0、25、50、75和100μmol/L）的Genistein,按照不同的时间（30、60和90 min）孵育后冷冻,检测冻后精子表观指标（活力、顶体完整率和质膜完整性）。结果提示:精液冷冻液中添加100μmol/L的Genistein孵育60 min,冻后精子活力显著高于对照组（P<0.05）,顶体完整率和质膜完整性略高于对照组（P>0.05）。结论:Genistein能够提高猪精子的冻后质量,且100μmol/L、60 min组效果较好。2.Genistein对猪精子冻后获能状态的影响。荧光分光光度计检测各组精子内Ca2+浓度;以处理组（100μmol/L,60 min）为研究对象,金霉素染色法检测精子的获能状态。结果提示:与对照组相比,各组中Ca2+浓度略降低（P>0.05）。处理组中获能精子数降低（P<0.05）。结论:Genistein能够抑制冻融过程中猪精子获能。3.Genistein对冻融和获能猪精子蛋白酪氨酸磷酸化水平的影响。以处理组（100μmol/L,60 min）和Genistein+获能组为研究对象,蛋白免疫印迹和间接免疫荧光法检测Genistein对冻融精子和获能精子蛋白酪氨酸磷酸化水平及酪氨酸磷酸化位点变化的影响。结果提示:（1）冻融精子中,与对照组相比,处理组中32 KDa和69 KDa蛋白酪氨酸磷酸化水平显著降低（P<0.05）。（2）获能精子中,与新鲜组相比,获能组和Genistein+获能组中58 KD蛋白酪氨酸磷酸化水平升高（P<0.05）,Genistein+获能组略低于获能组（P>0.05）。（3）冻融精子和获能精子蛋白酪氨酸磷酸化位点主要分布于顶体（a）区和顶体+顶体后（a+b）区且荧光较强。冻融精子中,与对照组相比,处理组中（a+b）区磷酸化位点降低（P<0.05）。（4）获能精子中,与获能组相比,Genistein+获能组中（a）区和（a+b）区磷酸化位点降低不显著（P>0.05）。结论:Genistein能够降低冻融和获能过程中精子（a+b）区的蛋白酪氨酸磷酸化。4.Genistein对冻融和获能猪精子PKA和PKG蛋白活性的影响。以处理组（100μmol/L,60 min）和Genistein+获能组为研究对象,酶联免疫法检测冻融精子和获能精子中PKA和PKG蛋白的活性。结果提示:（1）冻融精子中,与对照组相比,处理组中PKA蛋白活性降低显著（P<0.05）。（2）获能精子中,与获能组相比,Genistein+获能组PKA和PKG蛋白活性降低不显著（P>0.05）。结论:Genistein可能通过抑制c AMP/PKA信号通路中PKA蛋白的活性,从而抑制猪精子冻融过程中发生获能。5.Genistein对冻融和获能猪精子黏附蛋白家族基因（AQN1、AQN3、AWN、PSP-I和PSP-II）和SPMI基因m RNA表达的影响。以处理组（100μmol/L,60 min）和Genistein+获能组为研究对象,q PCR检测冻融精子和获能精子黏附蛋白家族基因和SPMI基因m RNA表达水平。结果提示:（1）冻融精子中,与对照组相比,处理组中AWN基因m RNA表达极显著升高（P<0.01）,PSP-I基因m RNA降低显著（P<0.05）,PSP-II和SPMI极显著降低（P<0.01）。（2）获能精子中,与获能组相比,Genistein+获能组中AQN1和AWN表达量极显著升高（P<0.01）,AQN3和SPMI表达量显著升高（P<0.05）,PSP-I和PSP-II表达量极显著降低（P<0.01）。结论:Genistein处理组中,精子黏附蛋白家族基因和SPMI基因m RNA表达优于冷冻对照组,且与新鲜组接近。总之,在猪精子冷冻液中添加Genistein对精子的冻后质量产生积极的影响,其可能通过降低冻融精子顶体区和顶体+顶体后区蛋白酪氨酸磷酸化和提高黏附蛋白（AQN1、AQN3和AWN）m RNA表达量抑制精子获能,通过降低黏附蛋白（PSP-I和PSP-II）以及SPMI m RNA表达量提高精子活力。试验为进一步研究Genistein对精子的保护机理提供了理论基础。