【摘 要】
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氨基甲酸乙酯（简称EC）存在于多种发酵食品中,有一定的神经毒性、强烈的肺毒性和致癌性,黄酒中EC含量相对较高。本论文通过将水解EC前体物质尿素的脲基酰胺水解酶（UA）展示在酿酒酵母细胞表面,以减少黄酒中的EC含量。主要研究内容及结论如下:（1）预测目标蛋白的三维结构和活性中心。通过同源建模的方法模拟UA的三维结构,相似性达到了70%,模型的准确度达到98%以上。Procheck评估模型质量,超过9
【基金项目】
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国家重点研发计划（2018YCF1604103）；
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氨基甲酸乙酯（简称EC）存在于多种发酵食品中,有一定的神经毒性、强烈的肺毒性和致癌性,黄酒中EC含量相对较高。本论文通过将水解EC前体物质尿素的脲基酰胺水解酶（UA）展示在酿酒酵母细胞表面,以减少黄酒中的EC含量。主要研究内容及结论如下:（1）预测目标蛋白的三维结构和活性中心。通过同源建模的方法模拟UA的三维结构,相似性达到了70%,模型的准确度达到98%以上。Procheck评估模型质量,超过98.5%的残基位于安全区域内,证明模型质量合格。查阅文献确定了UA与尿素反应的多个功能域是协同作用的,故不能判断适合展示UA的锚定蛋白。（2）以酿酒酵母AY12α为出发菌株,构建了2株低产尿素菌株AC、ACD和4株细胞表面展示UA菌株ACαD、ACCD、ACFD、ACAD。黄酒发酵验证6株重组菌株降解尿素的能力,其中突变菌株ACD黄酒发酵液中的尿素和EC含量分别降低了92.03%和67.76%,突变菌株ACCD黄酒发酵液中的尿素和EC含量分别降低了89.91%和56.35%。RT-q PCR结果显示,ACCD菌株的DUR1,2基因转录水平是出发菌株的15.3倍,是4株展示菌株中最高的。（3）探究UA在7株酵母菌中的位置分布以及细胞表面展示UA的酶学性质。珠磨-低温液氮法破碎酵母菌株的细胞壁,分别测定培养基上清、细胞内液、细胞壁中的UA酶活。数据显示,4株展示菌通过收集细胞壁测得的UA酶活高低分别是ACCD＞ACFD＞ACAD＞ACαD,且酶活随时间变化的趋势基本一致,在72 h达到顶峰。初步确定了表面展示UA酶的最适温度为34℃,最适pH为6;在60℃下,展示UA较商品化脲酶有更好的热稳定性;在金属离子、去垢剂、有机溶剂缓冲液中,展示UA较商品化脲酶有更好地耐受性。（4）表面展示UA在黄酒中的应用。经ACCD展示菌株处理后,商品化黄酒中的关键风味物质浓度变化不明显,尿素降解率和EC降解率分别达到了35.8%和38.8%;展示菌株具有较好的重复利用稳定性,且重复回收10次后,仍能达到80%的初始尿素降解率。
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