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1研究目的和意义糖尿病是一种临床常见的代谢性疾病,其发病率逐年增加,患病率及患病人数呈逐年上升趋势,预计全球的糖尿病患者数将从2013年的2.8亿增至2035年的5.9亿。糖尿病对机体产生广泛的影响,能累及视网膜,引发特有的糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)。DR是糖尿病患者常见的并发症之一,不仅是欧美等发达国家成年人致盲的首要因素,也是我国20～74岁成年人新发致盲的首要因素。积极探索DR的发病机制,为DR的临床治疗提供新理论、新方法具有重要意义。视网膜神经节细胞是视网膜中唯一能产生动作电位的神经元,其轴突形成了视神经,将视觉信息向视觉中枢传递,视网膜神经节细胞凋亡或结构功能受损是DR的重要机制之一。Nogo受体(Nogo receptor,NgR)广泛存在于神经组织,在视网膜内仅存在于RGC之中。NgR能与多种神经生长抑制因子结合,抑制神经元突起的延长,导致胞体萎缩,诱导细胞凋亡等,是抑制神经再生的重要因素,NgR在青光眼、视神经钝挫伤等动物模型视网膜神经节细胞内的表达均明显上升。因此,本研究拟观察NgR在糖尿病大鼠视网膜中的表达,利用RNAi方法抑制NgR在糖尿病大鼠视网膜中的表达,探讨NgR对糖尿病大鼠视网膜RGC的影响,并积极探讨参与该途径的NgR下游信号分子。期望通过本研究能进一步揭示DR发病机制,为DR的临床治疗提供新思路。2方法2.1沉默NgR基因腺病毒载体的构建：确定NgR基因RNA的干涉靶点,形成双链DNA oligo (NgR shRNA),制备pGenesil-1质粒,利用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切质粒pGenesill使其环形结构线性化,将线性化的pGenesil-1质粒载体与目的基因片段连接,将shRNA插入pGenesil-1质粒载体的U6启动子下游多克隆位点,pGenesil-1-shRNA重组质粒转化大肠杆菌DH5α,酶切鉴定pGenesil-1-shRNA重组质粒,构建重组穿梭质粒,在LipofectamineTM 2000的介导下包装重组腺病毒质粒,感染293细胞,鉴定并扩增重组腺病毒,梯度稀释法鉴定病毒滴度。2.2 NgR在糖尿病大鼠视网膜神经节细胞中的表达,及其对视网膜神经节细胞的影响：雄性SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病模型,糖尿病大鼠玻璃体腔内注射病毒包装的NgR反义核苷酸序列(siNgR组)、阴性核苷酸序列(scRNA对照组)或空白病毒液(糖尿病组),玻璃体腔内注射空白病毒液的正常SD大鼠为正常对照组。3个月视网膜HE染色,观察视网膜神经层厚度及节细胞密度的变化,免疫荧光组化检测NgR及其下游分子N-甲基-D-天门冬氨酸2B受体(NR2B)在视网膜神经节细胞内的共存情况,Western blot检测NgR及NR2B在视网膜内的表达。2.3 NR2B对体外培养视网膜神经节细胞凋亡的影响：ifenprodil为NR2B特异性抑制剂,分3组培养RGC：对照组、高糖组(含30 mmol/L葡萄糖)及高糖-ifenprodil组(含30 mmol/L葡萄糖、3 μmmol/L ifenprodil),分组培养3天后显微镜观察细胞生长状态,以四甲基噻唑蓝(Thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)检测细胞活力,Hoechst33342染色检测细胞凋亡状况,Western blot检测NR2B表达变化。3结果3.1成功构建了沉默NgR基因表达的腺病毒载体3.1.1 pGenesil-1质粒不仅包含两端的BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点,该质粒还包含一个KpnⅠ的酶切位点,该位点随Nogo shRNA插入在质粒的多克隆位点中,可以被KpnⅠ单酶切而发生线性化改变。本研究中酶切重组质粒之后可见两条电泳条带,提示酶切位点插入位置正确,与设计要求一致。3.1.2与穿梭质粒重组的腺病毒载体基因片段约900 bp,未重组病毒基因片段约450 bp。据此,本研究中穿梭质粒己与腺病毒发生了重组,重组腺病毒包装成功。3.1.3重组腺病毒转染293细胞后可见绿色GFP表达,其表达随着时间的延长而逐渐增多。荧光显微镜下可见荧光斑点数增多,荧光增强,荧光斑点逐渐扩大,并且出现明显的噬斑,呈现出病毒感染特有的细胞病理表现。3.1.4本研究构建病毒滴度为2.5×109 TU/ml,病毒滴度满足后续的在体实验和离体实验要求,可用于后续实验研究。3.2 NgR表达增加是糖尿病大鼠RGC数目减少的重要原因3.2.1成功建立了糖尿大鼠动物模型：糖尿病组、siNgR组、scRNA对照组大鼠血糖浓度均≥16.7 mmol/L,大鼠血糖浓度分别为(20.1±1.6)、(22.3±1.9)、(21.8±1.4) mmol/L,血糖浓度组间无差异(P>0.05),3组大鼠血糖浓度均高于正常对照组(4.2+0.5)mmol/L (P<0.001)。3.2.2免疫荧光染色检测结果显示,视网膜内NR2B阳性表达与NgR阳性结果均位于视网膜神经节细胞,二者在视网膜神经节细胞内大量共存。3.2.3正常组、糖尿病组、scRNA对照组及siNgR组视网膜内界膜至内核层内缘的厚度分别为(100.0±0.0)%、(50.3±4.2)%、(55.4土5.1)%及(96.3+6.4)%。糖尿病组及scRNA对照组较正常对照组变薄(P<0.01), siNgR组较正常对照组无明显变化(P>0.05)。3.2.4正常对照组、糖尿病组、scRNA对照组及siNgR组视网膜神经节细胞的密度分别为(1238±215)/cm2、(793±153)/cm2、 (838±178)/cm2及(1074±194)/cm2。糖尿病组及scRNA对照组较正常对照组节细胞数目减少(P<0.01),siNgR组较正常对照组数量无明显变化(P>0.05)。3.2.5正常对照组、糖尿病组、scRNA对照组以及siNgR组视网膜NgR蛋白表达量为(20.4±2.1)%、(42.6+5.2)%、(39.7+4.7)%、(20.4±2.1)%,NR2B蛋白表达量为(29.7±3.5)%、(50.7+7.5)%、(48.6±6.3)%、(28.7±4.9)%。糖尿病组、scRNA对照组视网膜NgR及NR2B较正常对照组表达均明显增加(P<0.01),siNgR组较正常对照组表达无明显变化(P>0.05)。3.3 NR2B表达增加能诱导体外培养的RGC凋亡3.3.1倒置显微镜观察细胞形态显示,高糖组细胞体积较对照组缩小,细胞边界折光性增强,高糖-ifenprodil组与对照组细胞形态差别不明显。3.3.2对照组、高糖组、高糖-ifenprodil组的RGC细胞活力为(100.0±0.0)%、(78.6±6.2)%、(95.3±8.1)%。RGC活力检测结果显示,高糖组细胞活力较对照组显著降低(P<0.01),高糖-ifenprodil组较对照组无显著变化(P>0.05)。3.3.3 Hoechst 33342染色显示,对照组、高糖组及高糖-ifenprodil组RGC凋亡率分别为(3.2±0.4)%、(16.4±1.5)%、(4.1±0.5)%。与对照组相比,高糖组RGC细胞凋亡率较高(P<0.01),高糖-ifenprodil组RGC细胞凋亡率无统计学差异(P>0.05)。与高糖组相比,高糖-ifenprodil组RGC细胞凋亡率明显降低(P<0.01)。3.3.4 Western blot检测显示,对照组、高糖组及高糖-ifenprodil组NR2B蛋白表达量分别为(30.3+3.7)%、(42.0+7.1)%、(39.3±6.2)%。与对照组相比,高糖组、高糖.-ifenprodil组NR2B蛋白表达增加(P<0.01),高糖组与高糖-ifenprodil组之间无显著统计学差异(P>0.05)。4结论4.1利用RNAi技术,以NgR为靶序列,成功构建了针对NgR基因的shRNA序列,并成功重组于腺病毒,构建了特异性抑制NgR表达的腺病毒载体。4.2利用293细胞包装并扩增了重组腺病毒颗粒,病毒滴度较高,为后续的在体研究和离体研究提供了工具,奠定了基础。4.3利用免疫双标技术证实了NgR及谷氨酸受体NR2B均表达于视网膜RGC细胞内,NgR与NR2B在视网膜RGC内大量共存。4.4证实了NgR表达增加是糖尿病视网膜RGC细胞缺失的重要原因之一。4.5证实了NgR能诱导NR2B在糖尿病大鼠RGC内的表达,抑制NgR能下调NR2B在视网膜的表达。4.6离体实验证实了谷氨酸受体NR2B能诱导RGC凋亡。4.7综上,糖尿病时,NgR表达上调促进了NR2B在视网膜RGC内的表达,是RGC凋亡的重要机制之一。