研究背景与目的 弓形虫(Toxopasma gondii)是严重影响健康的机会致病原虫。能在人类与家畜之间传播,呈世界性分布。它可侵犯除健康成熟红细胞以外的有核细胞,引起多器官组织的病变。对于正常人群,机体免疫力正常,则感染弓形虫后常为无症状带虫状态,然而对于特殊人群如当患有艾滋病、结核、肿瘤、器官移植后等免疫功能受损或抑制时,弓形虫就机会性感染引起明显的临床症状,甚至死亡。若孕妇患有弓形虫感染可引起胎儿畸形及流产,严重者可出现死胎。在家禽之间的传播导致大量家禽的死亡,造成严重的经济损失。因而预防弓形虫病的发生,早期诊断弓形虫病具有很大的临床价值。然而弓形虫寄生于宿主细胞内,直接取弓形虫病原体困难,而临床表现无特异性,单靠临床诊断非常困难。目前常用的方法有病原学、免疫学和分子生物学,每种方法各有优缺点。病原体直接镜检是传统方法,特异性高但容易漏诊,不能适应临床需要。免疫学诊断方法敏感性及特异性高,操作相对便捷,所以应用免疫学方法诊断弓形虫病更为重要。随着近几年分子生物学的发展,将有诊断价值的弓形虫抗原分子克隆到原核或真核表达载体,进行表达、纯化,从而获得高纯度抗原,特异性高,应用广泛。SAG2是表面抗原蛋白,GRA6、GRA7是致密颗粒蛋白,具有较强的抗原性和免疫原性。本研究首先构建了弓形虫的RH株SAG2、GRA6和GRA7基因的重组质粒pGEX-4T-SAG2、 pGEX-4T-GRA6和pGEX-4T-GRA7,并将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21,然后用IPTG体外诱导表达目的蛋白,纯化的蛋白作为包被抗原,对358份人源血清进行ELISA检测,为SAG2、GRA6和GRA7作为人、兽弓形虫病诊断抗原的研究奠定基础。方法1.目的基因的扩增 从弓形虫感染的小鼠腹水中提取RH株的基因组DNA,然后以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增,扩增产物电泳鉴定纯化回收。 2.重组质粒的构建 将PCR产物及载体pGEX-4T分别进行双酶切(EcoRI、BamHI),通过回收试剂盒回收酶切片段,将获取的目的片段与载体进行连接,将连接产物转化入E.coliTOP10感受态细胞。酶切鉴定后送基因公司测序。3.重组质粒的表达和纯化IPTG体外诱导表达,利用His-bindTM柱柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE I口免疫印迹分析。结果1.PCR特异地扩增出目的基因,SAG2、GRA6和GRA7扩增产物经电泳鉴定,大小分别为561、693和714bp,长度与理论值相符。2.重组质粒经EcoRI、BamHl双酶切,电泳显示在相应位置出现条带,与预期大小(561、693和714bp)一致。对酶切鉴定正确的重组质粒进行送样测序,测序结果经比对后与原始序列同源性100%,表明成功构建了重组质粒。3.采取各组份样品,进行SDS-PAGE分析,电泳显示在相应位置(47KD、52KD、53KD)出现明显条带,表明融合蛋白SAG2、GRA6和GRA7成功得到了表达,表达主要方式为包涵体表达。4.融合蛋白经过免疫印迹分析,在相应位置(47D、52KD、53KD)出现明显条带,表明融合蛋白SAG2、GRA6和GRA7表达正确。5.利用纯化的蛋白作为包被抗原,对人源358份血清的弓形虫IgG抗体检测,阳性率为3.07%-4.75%。进口的弓形虫诊断试剂盒对检测阳性的样本复检符合率为100%,48份阴性血清进行平行检测,结果均为阴性,与ELISA结果相符。