烤烟作为云南省重要的经济作物之一,其正常生长和质量形成都对水分条件有较高要求,如何使其在干旱胁迫情况下能维持正常生长,并使烟叶的产量和质量不受影响,一直是烟叶生产上急需解决的问题。本研究从云南省主栽烤烟品种红花大金元基因组中获得类扩展蛋白EXLA基因,以红花大金元为实验材料,通过不同浓度PEG6000模拟干旱处理,研究类扩展蛋白基因EXLA在干旱胁迫下的响应表达及蛋白功能分析,主要研究结果如下:1.采用不同浓度PEG溶液（0、10%PEG、15%PEG、20%PEG）模拟干旱胁迫对烟草种子萌发期、旺长期植株进行处理,观察烟草在干旱胁迫下表型变化。经过PEG处理后发现,种子萌发期对照组（CK）生长正常,10%PEG、15%PEG浓度中生长的幼苗叶片明显卷曲,叶片大小小于对照组。对旺长期植株处理24h后,对照组和10%PEG处理组的叶片无明显变化,15%PEG和20%PEG处理组叶片略微出现皱缩;48h后,对照组保持正常状态,10%PEG、15%PEG、20%PEG处理组叶片皱缩萎蔫,且15%PEG、20%PEG处理组萎蔫现象更为明显。通过对旺长期植株光合指标测定发现,与对照组相比,随着PEG浓度增加和PEG处理时间的延长,叶片净光合速率下降,且在48h接近零,胞间二氧化碳浓度上升,叶片气孔导度降低,叶片的蒸腾速率也表现下降趋势。2.经过不同浓度PEG处理后,对种子萌发期NtEXLA1-4基因进行表达分析。发现在10%PEG处理下NtEXLA2基因较快响应,相对表达量上升,15%PEG处理后,NtEXLA2、NtEXLA3、NtEXLA4的相对表达量表现为上升趋势。旺长期对植株进行干旱处理胁迫,在根部组织对照组NtEXLA1、NtEXLA2、NtEXLA3、NtEXLA4基因在0h、24h、48h的相对表达量差异不显著,10%PEG和15%PEG处理组NtEXLA1、NtEXLA2、NtEXLA3、NtEXLA4的基因表达量随处理时间的增加而升高,其中NtEXLA2和NtEXLA4基因在15%PEG处理组的基因相对表达量达到最高,NtEXLA2基因表达量是CK组的260.6倍,NtEXLA4基因表达量是对照组是92.6倍;而20%PEG处理组24h时NtEXLA1、NtEXLA2、NtEXLA3、NtEXLA4的基因表达量上调,较处理前高10倍以上。在茎部和叶部组织:不同PEG浓度处理后,随时间的增加,各基因在茎、叶中的表达量无明显变化规律。3.对NtEXLA2和NtEXLA4进行了生物信息学分析,结果表明:NtEXLA2和NtEXLA4的CDS序列长度分别为801 bp、792 bp,蛋白长度分别为266 aa、263 aa,分子量大小为28.98 k Da、28.44 k Da,两个基因蛋白结构相似,具有保守结构域DPBB。通过与水稻、拟南芥、渐尖叶烟草等类扩展蛋白基因的氨基酸序列进行系统进化树的构建,分析比较本实验获得的类扩展蛋白基因NtEXLA2和NtEXLA4同源性。构建NtEXLA2和NtEXLA4基因的亚细胞定位重组载体,表明NtEXLA2和NtEXLA4是位于细胞壁中的蛋白质,与预测结果一致。构建NtEXLA2和NtEXLA4基因的原核表达重组载体,His-NtEXLA2融合蛋白约为31k Da,His-NtEXLA4融合蛋白约为30k Da,His-NtEXLA2融合蛋白的最适诱导条件为1 m M IPTG,28℃,220 rpm培养5 h,His-NtEXLA4融合蛋白的最适诱导条件为0.5 m M IPTG,16℃,220 rpm培养16 h,通过SDS-PAGE电泳检测纯化后获得的目的条带与预测大小一致。4.以红花大金元为转基因受体材料,构建NtEXLA2和NtEXLA4超表达载体,通过叶盘法转化获得T0代植株,其中获得NtEXLA2超表达T0代30株,阳性植株19株,通过q RT-PCR分析,NtEXLA2基因在转基因超表达烟草中的表达水平,结果表明,过表达转基因株系OV2-2、OV2-13、OV2-17、OV2-24中NtEXLA2相对表达量显著高于野生型植株（WT）,其中,OV2-17株系的NtEXLA2的表达水平显著高于其他3个株系。此外,对抗氧化酶的基因相对表达量分析,与野生型植株相比,超表达株系中SOD基因表达量差异明显;POD和CAT两个酶基因相对表达量,超表达株系均显著高于野生型植株。获得NtEXLA4超表达阳性植株T0代31株,获得超表达株系为后续干旱胁迫实验提供植物材料。