伤寒沙门菌纳米生物传感器的研究

来源 :温州医学院 温州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:shizhijian
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目的:   通过物理方法将油脂荧光染料(4,4-Difluoro-5-(2-thienyl)-4-bora-3a,4a,-dia-z-as-indacene-3-dodecanoicacid,BODIPY558/568C12,以下简称BO558)掺入聚丁二炔(polydiacetylene,PDA)囊泡中,构建一种PDA/BO558荧光混合囊泡,并对荧光混合囊泡的基本特性、荧光强度变化原理及机制进行初步探究;将伤寒沙门菌纤毛特异性寡肽修饰于PDA/BO558荧光混合囊泡表面,构建能够识别伤寒沙门菌的寡肽纳米生物传感器,通过检测寡肽纳米生物传感器与伤寒沙门菌反应而引起的荧光光谱强度的变化,从而建立一种可以快速检测伤寒沙门菌的纳米生物传感器。   方法:   1.不同体系聚丁二炔囊泡的制备与表征:以PCDA单体、BO558为膜材,采用探头超声法制备两种不同体系的聚丁二炔囊泡,分别是纯PDA囊泡、PDA/BO558混合荧光囊泡。并采用透射电镜负染技术,对这两种囊泡进行形貌表征;采用紫外可见光吸收光谱技术、荧光光谱技术,对这两种囊泡进行特征吸收峰的表征。检测PDA/BO558囊泡随环境中酸碱度和温度变化而产生的荧光光谱的变化及比色响应值的改变,并初步了解PDA/BO558纳米囊泡荧光强度改变的特性。   2.PDA/BO558混合荧光囊泡的伤寒沙门菌纤毛特异性寡肽修饰:将伤寒沙门菌纤毛特异性寡肽通过酰胺化反应修饰到PDA/BO558混合荧光囊泡的表面,并通过可见光吸收光谱、荧光光谱检测,计算寡肽的修饰效率,实现生物传感器的组装以及对伤寒沙门菌的特异识别。   3.寡肽-纳米生物传感器的荧光光谱检测:由于寡肽纳米生物传感器上的寡肽与伤寒沙门菌间能够发生特异性识别并结合,利用此结合影响寡肽纳米生物传感器中聚丁二炔骨架构型而引起的荧光共振能量转移程度的改变,通过检测反应前后寡肽纳米生物传感器荧光光谱575nm处荧光强度的变化来定性或定量检测溶液中的伤寒沙门菌。并通过透射电子显微镜和激光共聚焦显微镜对寡肽纳米生物传感器与伤寒沙门菌之间的作用进行验证。   结果:   1.聚丁二炔囊泡的制备与表征:经透射电镜表征证实,纯PDA、PDA/BO558混合体系均能形成囊泡,直径40-100nm左右;经254nm紫外光照射后,纯PDA体系从无色变成蓝色,PDA/BO558混合体系从粉色转变成蓝色。PDA/BO558囊泡的荧光强度随环境中温度的增加而升高,随溶液中pH值的增加其荧光强度也有明显的增加。在PDA/BO558囊泡荧光强度的改变过程中,囊泡聚丁二炔共轭骨架的构型也发生了变化,说明荧光强度的改变与囊泡骨架构型的改变具有密切的关系。   2.伤寒沙门菌特异性识别寡肽修饰PDA/BO558荧光囊泡:经可见光吸收光谱、荧光光谱分析证实,成功将伤寒沙门菌纤毛特异性寡肽修饰到PDA/BO558荧光囊泡表面,经过可见光吸收光谱、荧光光谱的检测,计算其修饰率,修饰效率大约为80%。   3.寡肽纳米生物传感器的伤寒沙门菌检测:成功构建一种可以快速检测伤寒沙门菌的纳米生物传感器,并经透射电镜和激光共聚焦显微镜证实。其不需要特殊仪嚣,操作简便,检测时间短,仅需100min;灵敏度较高,检出限为105CFU/mL;线性范围为105~108CFU/mL;特异性强,对伤寒沙门菌的检测特异性为100%,不与鼠伤寒沙门菌、肠致病性大肠杆菌O111、肠出血性大肠杆菌O157:H7、乙型副伤寒沙门菌、福氏志贺菌、宋内志贺菌、单核细胞增生性李斯特菌等反应。   结论:   本研究成功制备PDA/BO558纳米荧光囊泡,并初步了解PDA/BO558纳米荧光囊泡荧光恢复的基本特性和相关机制;在PDA/BO558纳米荧光囊泡表面修饰伤寒沙门菌纤毛特异性寡肽,成功构建了伤寒沙门菌寡肽纳米生物传感器,通过检测寡肽纳米生物传感器荧光强度的变化,实现对伤寒沙门菌的快速检测,为以荧光共振能量转移为基础的PDA/BO558纳米囊泡在生物领域的应用提供了依据,并为肠道病原菌的检测提供了宝贵的经验。
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