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目的:1.探讨未羧化骨钙素如何影响大鼠的胰岛素分泌以及作用特点。2.探讨未羧化骨钙素与动作电位、电压门控性钾通道、电压门控性钙通道、细胞内钙离子浓度的关系。3.观察未羧化骨钙素是否通过磷脂酶C(phospholipase C,PLC)信号途径抑制了电压门控性钾通道,促进了胰岛素分泌。4.证实SD大鼠胰岛上是否有骨钙素相关受体-G蛋白耦联受体C家族6组成员A(G protein-coupled receptor family C,group 6,subtype A,GPRC6A)的表达。方法:1.大鼠胰岛的分离和培养用胶原酶P消化大鼠的胰腺,将得到的胰岛培养,待用。2.通过检测胰岛素分泌观察不同剂量的未羧化骨钙素对大鼠胰岛素分泌的影响将胰岛置于2.8 m M葡萄糖或16.7 m M葡萄糖的KRBH液中,用不同浓度的未羧化骨钙素(0.03 ng/ml,0.3 ng/ml)孵育,半小时后,吸取各组的上清液,-20℃保存备测。之后在各组的胰岛中加入酸乙醇,利用超声细胞粉碎仪破碎后,-20℃保存备测。3.通过检测胰岛素分泌观察不同葡萄糖浓度对未羧化骨钙素促胰岛素分泌作用的影响。将各组胰岛分别置于2.8 m M葡萄糖,11.1 m M葡萄糖或16.7 m M葡萄糖的KRBH液中,用未羧化骨钙素(0.3 ng/ml)孵育,半小时后,吸取各组的上清液,-20℃保存备测。之后在各组的胰岛中加入酸乙醇,利用超声细胞粉碎仪破碎后,-20℃保存备测。4.通过膜片钳实验探讨未羧化骨钙素与动作电位、电压门控性钾通道、电压门控性钙通道的关系。4.1β细胞的分离培养用DispaseⅡ消化法,消化大鼠的胰岛,将得到的β细胞放入培养箱中培养,待用。4.2电生理学测量利用全细胞膜片钳实验,探讨了未羧化骨钙素对离体大鼠胰岛β细胞动作电位、电压门控性钾通道、电压门控性钙通道的影响。5.通过检测胰岛素分泌探讨未羧化骨钙素促胰岛素分泌作用与电压门控性钾通道的关系将胰岛置于2.8 m M葡萄糖或16.7 m M葡萄糖的KRBH液中,用未羧化骨钙素(0.3 ng/ml)和(或)四乙基氯化铵(Tetraethylammonium chloride,TEA)(20 m M)孵育,半小时后,吸取各组的上清液,-20℃保存备测。之后在各组的胰岛中加入酸乙醇,利用超声细胞粉碎仪破碎后,-20℃保存备测。6.通过钙成像实验,探讨未羧化骨钙素与细胞内钙离子浓度的关系6.1β细胞的分离培养同前所述6.2测定β细胞内的钙离子浓度用荧光染料Fluo 4AM将大鼠胰岛β细胞染色,加入不同的药物,分别记录不同条件下细胞的荧光值。用荧光密度值(F)的改变来代表细胞内钙离子浓度的改变。7.通过膜片钳实验探讨未羧化骨钙素抑制电压门控性钾通道与磷脂酶C(phospholipase C,PLC)信号途径的关系β细胞的分离、培养和膜片钳实验步骤同前,药物溶解于相应的Kv外液中。8.通过检测胰岛素分泌探讨未羧化骨钙素的促胰岛素分泌作用与PLC的关系将胰岛置于2.8 m M葡萄糖或16.7 m M葡萄糖的KRBH液中,用未羧化骨钙素(0.3 ng/ml)和(或)U-73122(1μM,PLC的抑制剂)孵育,半小时后,吸取各组的上清液,-20℃保存备测。之后在各组的胰岛中加入酸乙醇,利用超声细胞粉碎仪破碎后,-20℃保存备测。9.通过检测胰岛素分泌探讨未羧化骨钙素促进胰岛素分泌的PLC下游的信号途径胰岛素分泌实验步骤同上,相应的药物换为Ro 31-8220(1μM,蛋白激酶C的抑制剂),或FTS-A(50μM,Ras蛋白的抑制剂),或PD 98059(20μM,MAPK/ERK激酶的抑制剂)。10.通过检测胰岛素分泌探讨未羧化骨钙素的促胰岛素分泌作用与腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)的关系胰岛素分泌实验步骤同上,相应的药物换为SQ 22536(10μM,AC的抑制剂)。11.Real-Time PCR和普通PCR检测结果:1.在低糖(2.8 m M)情况下,未羧化骨钙素(0.03 ng/ml,0.3 ng/ml)没有明显地影响胰岛素分泌(P>0.05 vs.2.8 G),在高糖(16.7 m M)情况下,未羧化骨钙素(0.03ng/ml,0.3 ng/ml)明显地促进了胰岛素分泌(P<0.05 vs.16.7 G)。数据表明未羧化骨钙素能促进大鼠的胰岛素分泌,但是,未羧化骨钙素没有影响胰岛中储存的胰岛素含量。2.在低糖(2.8 m M)情况下,未羧化骨钙素(0.3 ng/ml)没有明显地促进胰岛素分泌(P>0.05 vs.2.8 G),在高糖(11.1 m M)情况下,未羧化骨钙素(0.3 ng/ml)促进了胰岛素分泌(P<0.05 vs.11.1 G),在高糖(16.7 m M)情况下,未羧化骨钙素(0.3ng/ml)明显地促进了胰岛素分泌(P<0.01 vs.16.7 G)。数据表明未羧化骨钙素的促胰岛素分泌作用与葡萄糖浓度有关,但是,未羧化骨钙素没有影响胰岛中储存的胰岛素含量。3.未羧化骨钙素(0.03 ng/ml,0.3 ng/ml)延长了β细胞的动作电位时程,对照组的时程为47.2±4.8 ms,0.03 ng/ml未羧化骨钙素的时程为71.6±8.2 ms(P<0.05 vs.Ctrl)。0.3 ng/ml未羧化骨钙素的时程为76.1±4.8 ms(P<0.05 vs.Ctrl)。4.未羧化骨钙素(0.03 ng/ml,0.3 ng/ml)没有影响β细胞动作电位的幅度。对照组的动作电位幅度为77.2±3.0 m V,0.03 ng/ml未羧化骨钙素的动作电位幅度为77.2±4.6 m V(P>0.05 vs.Ctrl),0.3 ng/ml未羧化骨钙素的动作电位幅度为75.7±4.3 m V(P>0.05 vs.Ctrl)。5.未羧化骨钙素(0.03 ng/ml,0.3 ng/ml)抑制了β细胞的电压门控性钾通道,在测试电压为0 m V时,对照组的电流密度为22.3±2.8 p A/p F,0.03 ng/ml未羧化骨钙素的电流密度为15.3±2.1 p A/p F(P<0.05 vs.Ctrl),0.3 ng/ml未羧化骨钙素的电流密度为13.7±1.4 p A/p F(P<0.05 vs.Ctrl)。6.未羧化骨钙素没有影响β细胞的电压门控性钙通道,在测试电压为0 m V时,对照组的电流密度为-4.0±0.5 p A/p F,未羧化骨钙素的电流密度为-4.2±0.6 p A/p F(P>0.05 vs.Ctrl)。7.在高糖(16.7 m M)情况下,单独的未羧化骨钙素(0.3 ng/ml)和TEA(20 m M)均明显促进了胰岛素的分泌(P<0.01 vs.16.7 G),但在TEA(20 m M)存在时,未羧化骨钙素没有进一步地促进胰岛素分泌(P>0.05 vs.16.7 G+TEA)。实验表明未羧化骨钙素的促胰岛素分泌作用是与电压门控性钾通道相关的,但是,未羧化骨钙素没有影响胰岛中储存的胰岛素含量。8.在2.8 m M葡萄糖情况下,未羧化骨钙素(0.3 ng/ml)没有影响细胞内的钙离子浓度。在16.7 m M葡萄糖情况下,未羧化骨钙素(0.03 ng/ml,0.3 ng/ml)提高了细胞内的钙离子水平;但在20 m M的TEA存在时,未羧化骨钙素没有进一步影响胰岛β细胞中的钙离子水平。9.未羧化骨钙素通过PLC抑制了β细胞的电压门控性钾通道,在测试电压为80m V时,对照组的电流密度为102.1±7.2 p A/p F,骨钙素组的电流密度为70.3±5.7 p A/p F(P<0.05 vs.对照组),U-73122组的电流密度为101.1±8.0 p A/p F,骨钙素+U-73122组的电流密度为97.9±8.7 p A/p F(P<0.05 vs.骨钙素组)。10.未羧化骨钙素通过蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)抑制了β细胞的电压门控性钾通道,在测试电压为80 m V时,对照组的电流密度为94.8±5.7 p A/p F,骨钙素组的电流密度为63.2±7.0 p A/p F(P<0.01 vs.对照组),Ro 31-8220组的电流密度为92.6±6.3 p A/p F,骨钙素+Ro 31-8220组的电流密度为95.7±5.6 p A/p F(P<0.01 vs.骨钙素组)。11.未羧化骨钙素通过Ras蛋白抑制了β细胞的电压门控性钾通道,在测试电压为80 m V时,对照组的电流密度为98.3±9.7 p A/p F,骨钙素组的电流密度为68.6±4.4p A/p F(P<0.05 vs.对照组),FTS-A组的电流密度为101.6±5.6 p A/p F,骨钙素+FTS-A组的电流密度为96.0±10.8 p A/p F(P<0.05 vs.骨钙素组)。12.未羧化骨钙素通过MAPK/ERK激酶(MAPK/ERK kinase,MEK)抑制了β细胞的电压门控性钾通道,在测试电压为80 m V时,对照组的电流密度为118.1±12.4p A/p F,骨钙素组的电流密度为75.1±7.3 p A/p F(P<0.05 vs.对照组),PD 98059组的电流密度为113.6±8.9 p A/p F,骨钙素+PD 98059组的电流密度为113.2±11.3 p A/p F(P<0.05 vs.骨钙素组)。13.在高糖(16.7 m M)情况下,未羧化骨钙素(0.3 ng/ml)明显地促进了胰岛素分泌(P<0.01 vs.16.7 G),加入U-73122(1μM)后,骨钙素促进胰岛素分泌的作用被明显抑制(P<0.01 vs.16.7 G+骨钙素)。这些数据提示PLC是未羧化骨钙素促进胰岛素分泌的一个重要成分。14.在高糖(16.7 m M)情况下,未羧化骨钙素(0.3 ng/ml)明显地促进了胰岛素分泌(P<0.01 vs.16.7 G),加入Ro 31-8220(1μM)后,未羧化骨钙素促进胰岛素分泌的作用被抑制(P<0.01 vs.16.7 G+骨钙素)。这些数据提示未羧化骨钙素通过PKC促进了胰岛素分泌。15.在高糖(16.7 m M)情况下,未羧化骨钙素(0.3 ng/ml)明显地促进了胰岛素分泌(P<0.01 vs.16.7 G),加入FTS-A(50μM)后,未羧化骨钙素促进胰岛素分泌的作用被抑制(P<0.01 vs.16.7 G+骨钙素)。这些数据提示未羧化骨钙素通过作用于Ras蛋白促进了胰岛素分泌。16.在高糖(16.7 m M)情况下,未羧化骨钙素(0.3 ng/ml)明显地促进了胰岛素分泌(P<0.01 vs.16.7 G),加入PD 98059(20μM)后,未羧化骨钙素促进胰岛素分泌的作用被抑制(P<0.01 vs.16.7 G+骨钙素)。这些数据提示未羧化骨钙素通过作用于MEK促进了胰岛素分泌。17.在高糖(16.7 m M)情况下,未羧化骨钙素(0.3 ng/ml)明显地促进了胰岛素分泌(P<0.01 vs.16.7 G),加入SQ 22536(10μM)后,骨钙素促进胰岛素分泌的作用没有受到影响(P>0.05 vs.16.7 G+骨钙素)。这些数据提示AC依赖性的信号途径不是未羧化骨钙素促胰岛素分泌作用的主要途径。18.荧光定量PCR结果和普通PCR结果均表明胰岛中不存在或极少存在GPRC6A基因的表达。结论:1.未羧化骨钙素促进了SD大鼠的胰岛素分泌,这种作用依赖于葡萄糖浓度,但可能不是通过GPRC6A受体完成的。2.未羧化骨钙素没有影响电压门控性钙通道的特性,而是通过抑制电压门控性钾通道,延长了动作电位的时程,增加了细胞内钙离子的水平,促进了胰岛素的分泌。3.未羧化骨钙素通过PLC/PKC/Ras/MEK途径,抑制了电压门控性钾通道,促进了胰岛素的分泌。