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甘露寡糖是由2-10个葡萄糖、甘露糖分子构成的甘露低聚糖。本研究利用甜瓜-白粉病病害体系检测甘露寡糖的诱导抗病作用。结果证实甘露寡糖能降低白粉病的发生。经甘露寡糖处理后的甜瓜叶片中几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、多酚氧化酶、过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶的活性均有不同程度的增强。其中几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶分别在第13d和16d达到最高峰,以后酶的活性逐渐下降至对照水平:而苯丙氨酸解氨酶的活性一直处于上升趋势,后期(5-6 d)最为明显;同时寡糖也明显激发了多酚氧化酶和过氧化物酶活性。 β-甘露聚糖酶(EC3. 2. 1. 78)是一类能够水解含有β-1,4-D-甘露糖苷键的甘露寡糖、甘露多糖的水解内切酶,可以将植物胶水解成由2-10个单糖分子构成的甘露低聚糖。本研究从不同地区的土样中分离到高产β-甘露聚糖酶的一株细菌Z-2,通过16SrDNA序列同源性分析及生理生化性状测定将菌株Z-2鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对粗酶性质的初步研究证明其酶稳定pH范围较宽(pH5.0-pH8.0),最适pH为6.0;在40-55℃酶活力保持稳定,最适温度为50℃,高于55℃酶活力迅速下降。酶解产物经薄层层析证明为低聚糖,不含单糖。 通过粘粒pLARF-5构建菌株Z-2的基因组文库,通过PCR介导的筛选方法,从Z-2基因组文库中获得甘露聚糖酶基冈man。以pET22b(+)为载体,构建pET-Ncol3(pelB信号肽)和pET-NdeI18(野生型信号肽)两种表达载体,E coli BL21(DE3)为宿主菌,经IPTG诱导,两种载体都成功的表达了man基冈。pET-NcoI3的Man胞外活性是pET-NdeI18的2倍。为了增加胞外酶的产量,本文对培养基、培养温度、IPTG的诱导浓度、菌体的浓度4个因素进行了优化,结果表明当采用TB培养基,37℃振荡培养,当菌体浓度达剑OD600=0.75时,加入IPTG诱导4h(终浓度为0.01 mM),培养基中甘露聚糖酶的活力可达到55.33U/mL,显著高于野生菌产生酶的活力(41.82U/mL)。 由丁野生型man基因在Pseudomonas fluorescens 2P24中不表达或表达量较低,通过遗传改造野生man基因的起始密码子(TTG→ATG),核糖体结合位点(GGGGAG→AAGGAG)和信号肽(野生型→pelB信号肽),构建出3个表达结构,分别连接在穿梭载体pRK415上转化Pseudomonas fluorescens 2P24。活性测定结果表明,培养基中不加魔芋粉时Man诱导活性很低,加入后胞内和胞外均诱导目的蛋白的积累,改造后的质粒胞外活性为1.55 U/mL,胞内约为3.8U/mg。苗期生测结果表明,转入man基因2P24菌株对烟草花叶病有一定的防病效果。