大黄鱼肠道乳酸菌的分离与鉴定

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我们利用T-RFLP方法分析了大黄鱼肠道不同部位中可培养异养细菌的群落结构。结果表明,大黄鱼肠道中可培养异养细菌的优势菌群的16SrRNA基因大小在494bp处,属于不动杆菌属(Acinetobacter sp.);前肠微生物的多样性明显的少于盲囊、后肠及粪便三个部位的多样性。  乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一类革兰氏阳性菌,通常不运动,不形成孢子,乳酸为其唯一的或是主要的发酵代谢产物。乳酸菌广泛分布在自然界,而且在工业、农业和医药等与人类密切相关的重要领域的实际应用价值越来越高。  本研究用MRS培养基从大黄鱼肠道分离出15株触酶阴性,革兰氏阳性的菌株。通过形态学观察、生理生化特性测定、16S rRNA基因序列分析、药物敏感检测对其进行分类鉴定,确定其中8株菌为格氏乳球菌,其余为葡萄球菌和地衣芽孢杆菌。这是从正常鱼体内分离到不具致病性的格氏乳球菌的首次报道。8株格氏乳球菌的生理生化特性相似:最适生长温度为37℃,当培养温度上升到50℃时,菌株不生长;最适 pH为6.8左右;最适盐度为2%,在含盐量为6.5%的培养基上不生长;不能利用乳糖,能够利用其他糖类像阿拉伯糖、纤维素二糖、麦芽糖、松三糖、鼠李糖、葡萄糖等;溶血性试验结果表明8株格氏乳球菌均为α溶血;药物敏感试验显示该菌株对氨苄青霉素、红霉素、阿奇霉素和阿莫西林高敏;对头孢拉定、万古霉素、环丙沙星、氯霉素、噻孢霉素、氧氟沙星敏感;对卡那霉素、头孢呋辛、替硝唑和链霉素耐受。  研究不同因子对试验菌株生长的影响,我们发现菌株对胆盐有一定的耐受性,在胆盐浓度为0.4%时,菌株依然可以成活,但成活率明显降低;在耐酸性试验中,菌株在pH3的培养基中成活率达16.18%以上;在2%浓度的胰蛋白酶中,各菌株的成活率在13.80%以上;盐度耐受试验中,菌株可以在0%-6%盐浓度的培养基上生长,生长率在50%以上,当盐度为2%时,生长率最高达99.34%;不同温度对菌株的成活率影响试验中,菌株在15-45℃的培养条件下成活率在达20.78%以上。  我们对格氏乳球菌的致病性进行了研究,用0.1mL菌液(1.0×107CFU/mL)人工感染小鼠(30d)、鲈鱼和大黄鱼(15d)。结果小鼠、鲈鱼和大黄鱼都未死亡,也没有出现感染该致病型菌的症状,但是16sPCR结果表明,小鼠、鲈鱼和大黄鱼菌被格氏乳球菌感染。其次,我们利用特异性引物Lg来验证格氏乳球菌是否具有荚膜结构,试验中我们以分离菌株的DNA为模版进行PCR扩增,然后电泳,我们看到在746bp处出现了一条清晰的条带,由此从分子的角度证明我们分离到菌株均是没有致病性的。综上试验结果,我们证实从大黄鱼肠道中分离到的格氏乳球菌是非致病菌。
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