番茄成熟相关NAC类基因的分离和功能初步鉴定与分析

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NAC转录因子基因家族是植物所特有的基因家族,也是植物中最大的基因家族之一。NAC转录因子最初来源于矮牵牛NAM基因和拟南芥ATAF1、ATAF2和CUC基因的一段共有的序列。NAC转录因子家族基因在植物的生长和发育过程中起着重要的作用,通过在不同的发育阶段和组织中表达调控植物的生长和发育,调节着胚胎的发育,顶端分生组织的形成,侧根的发育,激素信号的传导,对生物逆境和非生物逆境的反应,果实的成熟等。番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)果实成熟研究是目前研究的热点。本实验室获得了一株T-DNA插入的番茄成熟突变体,其植株的果实成熟特征与nor和rin突变体相近,果实很难成熟,且喷施乙烯并不能使其成熟,只是成熟期果实颜色比nor和rin突变体果实略深,通过对侧翼序列的分析,发现T-DNA插入到NAC基因家族的一个成员中,我们把这个基因命名为Nur(Null ripe),其插入突变命名为Nur。生物信息学分析发现,Rin、Nur和Nor基因都是转录因子,表明转录因子在果实的发育中起着重要的调节作用,这些基因表型说明其可能在果实成熟反应的上游调控着果实的成熟。生物信息学分析还发现,Rin基因的同源基因可能调控着草莓,拟南芥等非呼吸跃变型果实的成熟,表明在所有类型的果实中存在着共同的调控因子。而Nur和Nor基因同属于NAC转录因子基因家族,两者的同源性为65%。因此,本实验通过生物信息学的手段,从Nur和Nor以及其他已知NAC基因入手,寻找一些可能与果实成熟相关的NAC基因,分析这些NAC基因对果实成熟的影响,这对阐明果实成熟的分子机理有着重要的理论意义,同时对生产实践中的育种工作也有较大的应用价值。本研究主要结果如下:1.利用生物信息学的手段从番茄核酸数据库中获得了21个全长NAC基因,通过多序列联配发现:番茄NAC基因N末端高度保守,而C末端高度差异;NAC结构域由A、B、C、D、E五个亚结构域组成。2.通过构建生物进化树并结合已知的NAC基因的功能、数字表达谱等方法,对番茄中的NAC基因进行了分类和初步的功能预测;筛选出两个可能与果实成熟相关的基因:SGN-U213215(NAC15)、SGN-U213218(NAC18)。3.利用RFLP分析了Nur基因在M82和LA716两个番茄品种中的多态性,结果表明Nur基因在这两个品种中有明显的多态性,结果还显示Nur基因为单拷贝基因。4.利用76个IL群体将Nur基因定位在番茄第2染色体的2-A区域。5.克隆了三个全长NAC基因:NAC15、NAC18、Nur基因,并通过了测序验定。6.构建了NAC18基因的超量表达和反义抑制植物遗传转化载体,Nur基因的超量表达植物遗传转化载体。7.对全长Nur基因的RNA干涉株系进行了分子及生理检测发现:NurR2株系为转基因株系,NurR2的果实不能成熟,没有呼吸跃变,果实硬度显著大于对照,种子与对照相比很小。8.发现Nur基因的同源基因AtNAC2可能与拟南芥果实的成熟相关,表明可能在所有类型的果实中存在这共同的成熟调控因子。
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