小分子化合物诱导脊髓内神经元重编程及相关分子机制研究

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成年哺乳动物中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)再生能力极其有限,疾病和损伤等病理条件所致不可逆性神经元死亡、缺失是导致CNS功能障碍的主要因素之一。因此,如何补充、替代这些不可逆性丢失的神经元是促进CNS神经功能有效修复的关键问题,而在体内诱导新生神经元则是解决这一问题的理想方法之一。近几年来,一系列研究表明,非神经元成体细胞可以通过过表达神经元特异性转录因子(Transcription factors,TFs)进行重编程转分化为神经元。然而,这一方法的有效性与安全性仍是制约其临床应用的关键问题。作为神经元重编程(Neuronal reprogramming)的另一策略,即使用针对特定信号通路和/或表观遗传特征的小分子化合物诱导非神经元成体细胞转分化为神经元,可能为解决这一难题提供新的思路。目前,已经发现有一些小分子化合物在体外具有维持干细胞的自我更新潜力、诱导前体细胞特化、提高重编程效率和/或取代转录因子诱导神经元重编程等多种作用。本研究重点在于寻找能够在体内有效诱导神经元重编程的小分子化合物。
  星形胶质细胞是CNS中广泛分布、数量最多的胶质细胞,在内环境稳态维持、神经元供能、突触修剪等多方面发挥着重要的功能。在CNS病变或损伤后,星形胶质细胞往往会被激活,在形态和功能等方面呈现相应的变化,被称为反应性星形胶质细胞(Reactive astrocytes,RAs)。在体外培养条件下,反应性星形胶质细胞可以自发形成神经球、多次传代并拥有三系(神经元、星形胶质细胞及寡突胶质细胞)分化的能力,表明其具有一定的干/前体细胞特性。相关研究表明,体外培养的星形胶质细胞在经过适当的小分子化合物诱导后,可以转分化为神经元并表现出成熟神经元功能。然而,小分子化合物是否能够诱导在体神经元重编程,目前尚未见相关的研究报道。
  本研究运用多种实验方法,寻找能对损伤后反应性星形胶质细胞进行神经元重编程的有效小分子化合物,以期为临床上CNS病变或损伤条件下探索与设计理想的神经元再生策略开拓新思路。研究取得的主要结果如下:
  一、CHIR99021和LDN193189能够成功地在体诱导星形胶质细胞实现神经元重编程
  1、体外培养条件下,使用小分子化合物CHIR99021和LDN193189能够诱导星形胶质细胞转分化为DCX阳性细胞,并且出现明显形态改变,呈现出类似幼稚神经元的形态特征。
  2、在诱导开始2周左右,新生神经元逐渐分化成熟,表达神经元特异标志蛋白,如TUBB3、MAP2和NeuN等。
  3、在诱导过程中,Ngn2、NeuroD1和Myt11等经典神经元相关转录因子表达持续上调,并伴随DCX和TUBB3等神经元特异基因表达升高。
  4、在成年小鼠体内,通过腹腔注射CHIR99021和LDN193189可以将脊髓损伤处周围的反应性星形胶质细胞诱导重编程为神经元,而正常星形胶质细胞则不发生重编程。
  5、诱导新生的神经元可以在脊髓内存活超过1年,并且这一诱导重编程方法在老年小鼠损伤脊髓中也被证实有效。
  二、Notch1信号通路在星形胶质细胞-神经元重编程中具有重要作用
  1、Notch1信号通路参与了由Ascl1和Ngn2介导的星形胶质细胞-神经元重编程过程。
  2、在体外培养条件下,使用Notch1的RNA干扰慢病毒或特异性抑制剂DAPT均可以将星形胶质细胞诱导重编程为神经元,表达成熟神经元相关特异标志蛋白如TUBB3、MAP2和NeuN等。
  3、Notch1表达于脊髓内正常及反应性星形胶质细胞中,在脊髓损伤后其表达量变化程度与星形胶质细胞活性程度相吻合。
  4、通过脊髓内注射Notch1的RNA干扰慢病毒或腹腔注射特异性抑制剂DAPT,脊髓损伤处周围的反应性星形胶质细胞能够被诱导重编程为神经元并分化成熟。
  综上所述,本研究发现,反应性星形胶质细胞具有向神经元重编程的潜能。通过腹腔给予CHIR99021和LDN193189可以成功将脊髓内反应性星形胶质细胞重编程为神经元。另外,我们还发现Notch1信号通路在星形胶质细胞-神经元重编程过程具有重要作用,阻断Notch1信号通路也能够将脊髓内反应性星形胶质细胞重编程为神经元。这些研究结果将为临床治疗CNS病变或损伤所致的不可逆性神经缺失提供新的思路。
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