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Caspases蛋白酶家族在细胞凋亡与炎症反应过程中起着重要作用，参与机体清除病原微生物等免疫反应。凋亡抑制因子IAPs是一类高度保守的内源性抗细胞凋亡因子家族，主要通过抑制caspases活性和参与调节核因子NF-κB的作用而抑制细胞凋亡。本实验室在前期研究中，从拟穴青蟹（简称青蟹）胚胎转录组中筛选出一个caspase基因(Sp-caspase)和一个IAP基因。Sp-caspase具有caspases蛋白酶家族保守的结构域P20和P10，并且具有高度保守的QACRG五肽序列，与果蝇Dcp1和DrICE氨基酸序列同源性很高;IAP基因具有三个BIR结构域和一个RING结构域，与斑节对虾（Penaeus monodon）PmIAP和凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）LvIAP高度同源。本论文比较系统地研究了Sp-caspase基因的完整基因序列、基因组结构特点、组织器官分布及其在LPS和细菌诱导下的表达变化;利用原核表达技术获取tSp-caspase和P20蛋白，证明Sp-caspase蛋白具有与人类caspase3/7相似的底物识别特性;并通过在细胞系中异源表达Sp-caspase蛋白，初步探索该蛋白在免疫及促细胞凋亡中的生物学功能。同时克隆获得了青蟹IAP基因的cDNA序列，并研究其组织器官特异性分布及在LPS和细菌诱导下的表达模式，为进一步探讨Sp-caspase和IAP基因在细胞凋亡过程中的非特异性免疫作用奠定基础。 本研究获得结果如下: (1)克隆获得了青蟹caspases家族成员Sp-caspase的全长cDNA(GenBank登录号:KX151140)及基因组DNA序列(GenBank登录号:KX151141)。Sp-caspase全长cDNA序列包括开放阅读框(ORF)966bp，5非编码区(UTR)350bp，3非编码区1511bp。ORF编码322个氨基酸，预测蛋白分子量为36kDa，生物信息学分析显示该基因有caspases蛋白酶家族保守结构域，包括一个前结构域(prodomain)、P20大亚基和P10小亚基三部分。通过系统进化树分析和氨基酸序列同源性比较，发现Sp-caspase与哺乳动物以及果蝇凋亡效应caspases具有较高同源性。用巢式PCR等方法揭示了青蟹Sp-caspase基因组DNA序列及其基因组结构，Sp-caspase基因有8个外显子和7个内含子，其中第一个内含子位于5UTR区，在起始密码子ATG前第11和第10个碱基之间插入。 (2)克隆获得了青蟹IAP基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KX151142)。IAP全长cDNA序列包括ORF1987bp，5非编码区500bp，3非编码区1071bp。其ORF编码661个氨基酸，预测蛋白分子量大小为72kDa，具有三个BIR结构域和一个RING结构域。与斑节对虾PmIAP氨基酸序列一致性为49％，与凡纳滨对虾LvIAP1一致性为49.93％。 (3)阐明了Sp-caspase和IAP基因mRNA转录本在正常青蟹各组织器官中的表达分布特性及在细菌和LPS刺激下基因在青蟹中肠、血淋巴、肝胰腺和鳃中的表达模式。A、利用real-time PCR检测Sp-caspase mRNA在正常雌性和雄性青蟹各组织器官中的分布情况，结果显示Sp-caspase在所检测的组织中均有表达，其中在雄蟹中肠中表达量最高，在肝胰腺、血淋巴细胞中表达量也较高;在雌蟹卵巢和中肠中表达量最高，在血淋巴细胞、肝胰腺中表达量也较高;但无论雌蟹还是雄蟹，Sp-caspase基因在心脏和肌肉中的表达量都很低。B、IAP基因在雄蟹肝胰腺中表达量最高，储精囊、胸神经团和血淋巴细胞中次之;在雌蟹血淋巴细胞、肝胰腺、卵巢中表达量也较高;在雌蟹和雄蟹均为眼柄、心脏和肌肉中表达量最低。C、用副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）人工感染后，在中肠、鳃中Sp-caspase基因转录水平均被显著诱导表达;中肠、鳃和血淋巴细胞中IAP基因转录水平也被显著诱导表达，并且中肠中IAP诱导表达均要早于Sp-caspase，而鳃中IAP诱导表达则晚于Sp-caspase，肝胰腺中两个基因均未被诱导。D、LPS刺激下，中肠、血淋巴细胞、肝胰腺和鳕中Sp-caspase和IAP基因mRNA水平均被显著诱导表达，并且IAP基因的诱导表达均要早于Sp-caspase基因。 (4)将Sp-caspase基因去除前结构域(Prodomain)后的序列（称tSp-caspase）、P20和P10亚基分别构建到pET-28a原核表达载体上，表达并纯化目的蛋白，分别检测其caspases酶活力。重组蛋白tSp-caspase和P20具有与人类caspase3/7相似的底物识别特性（对DEVD能够有效识别），进一步证明了Sp-caspase属于凋亡效应caspase。 (5)异源表达Sp-caspase可特异性诱导细胞凋亡:HighFive(来自于粉纹夜蛾Trichopulsia ni亲本细胞系的克隆分离株)、人胚肾293T细胞(human embryonickidney293T cells，HEK293T)、人宫颈癌细胞(human cervical cancer cells，HeLa)异源表达Sp-caspase后，细胞形态观察和TUNEL检测，有明显的细胞凋亡现象发生;利用AnnexinⅤ-FITC/Hoechst染色检测早期细胞凋亡的形态学变化，可以观察到明显的细胞核破裂，细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻。证明了其作为效应caspase，具有促细胞凋亡的生物学功能。