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背景:慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)约占所有成人白血病的20%,仅次于急粒和急淋白血病,处于白血病的第三位,一般具有BCR-ABL特征性的Ph染色体,是一种具有浸润特征的恶性克隆性疾病。其能够使细胞过度增长、凋亡受到抑制、迁移侵袭能力发生改变、细胞分化受到干扰等。K562是从CML病人红白细胞中分离得到,具有肿瘤干细胞的特征,不具有分化能力,是研究CML理想的细胞模型。CRK接头蛋白在禽类肉瘤病毒CT10(chicken tumor 10)中被发现,由SH2和SH3结构域构成,是致癌基因v-CRK的产物。CRK蛋白家族包括CRKⅠ、CRKⅡ和CRKL,三者均在各种组织中表达。CRK家族通过酪氨酸激酶和小G蛋白等信号分子来调控细胞的转录、增殖、分化和凋亡等生物学行为。CRKL和CRKⅡ作为CRK家族的成员,结构相似,具有高度同源性,可通过SH2和SH3结构域招募信号分子。CRKL和CRKⅡ的异常表达与肿瘤有密切联系,但两者共同对肿瘤的作用研究较少。本组前期研究发现,CRKL影响K562的增殖、迁移侵袭和巨核分化等生物学功能,CRKL下调可引起CRKⅡ表达增加,但具体机制尚不清楚。本论文通过下调K562中CRKL的表达来研究对K562分化的影响、下调CRKⅡ和双敲降CRKⅡ和CRKL来研究两者对K562分化、增殖、迁移和侵袭能力的影响,进而探讨CRKⅡ和CRKL各自功能、作用机制及相互间关联。目的:1、探讨CRKL对K562红系分化影响及分子机制;2、探讨CRKⅡ下调对K562增殖、迁移侵袭和红系分化的影响;3、CRKⅡ和CRKL功能及机制间联系。方法:1、qRT-PCR检测CRKL和CRKⅡ在14例非恶性(各种非恶性血液疾病)、33例初发、5例配对(初发-缓解CR)患者组和正常人组中的表达;2、Hemin诱导和联苯胺染色检测CRKL在K562红系分化中的作用、基因芯片和蛋白质组学检测CRKL下调对K562红系分化特征分子表达水平的影响;3、WB法检测CRKL下调对Raf/MEK/ERK/Elk-1通路中分子表达水平的影响;4、WB法和qRT-PCR检测CRKⅡ蛋白在K562中的下调表达水平;5、CCK-8法检测CRKⅡ下调对K562体外恶性增殖能力的影响、Transwell法检测K562的迁移和侵袭能力、qRT-PCR检测CRKⅡ下调对K562红系分化影响;6、WB法检测CRKⅡ下调对p130Cas/CRK/Rac1和Raf/MEK/ERK/Elk-1通路中分子表达水平的影响;7、免疫共沉淀分析CRKL和CRKⅡ在K562的相互作用;8、台盼蓝计数法检测CRKL+CRKⅡ双敲降K562的增殖能力、Transwell法检测K562的迁移和侵袭能力、qRT-PCR检测K562红系分化影响;9、WB法检测CRKL+CRKⅡ双敲降后,ERK、p-ERK和Rac1的表达。结果:1、qRT-PCR结果显示CRKL在CML初发患者骨髓样本中显著高表达,比正常组高出6.2倍(P=0.009),在CR中低表达。CRKL在5例配对样本中,有5例在CML初发患者中高表达,CR时低表达(P=0.0165)。与正常组相比,CR组CRKL水平降低(P=0.0258)。CRKⅡ在初发患者骨髓样本中略高表达,比正常人高出1.8倍(P=0.0855),在CR中低表达。在5例配对样本中,有3例在CML初发患者中高表达,CR时低表达(P=0.1014)。与正常组相比,CR组CRKⅡ无变化(P=0.1051);2、Hemin诱导K562后CRKL表达量降低,在诱导后的1、2 d时蛋白水平分别降低了52.8%(P=0.0007)和54.6%(P=0.0004),CRKⅡ表达变化不明显;与NC阳性细胞率3.4%相比,CRKL下调引起红系阳性细胞率增加10.5%(P=0.0239),标志分子GPA和γ-globin表达水平分别上升了59.4%(P=0.0096)和96.9%(P=0.0006),出现了HBA和HBD等血红蛋白;3、CRKL下调使GATA-1和HMGB2表达水平升高;4、CRKL下调激活Raf/MEK/ERK/Elk-1通路;5、CRKⅡ下调使K562体外迁移和侵袭能力分别降低了54.7%(P=0.0221)和56.1%(P=0.013),对红系分化无明显影响;6、CRKⅡ下调抑制p130Cas/CRK/Rac1通路,对Raf/MEK/ERK/Elk-1通路影响不大;7、CRKL和CRKⅡ在K562中可以结合形成复合物;8、与CRKL下调细胞相比,CRKL+CRKⅡ双敲降抑制K562增殖能力,细胞迁移侵袭能力又降低了35.9%(P=0.0024)和44.8%(P=0.0115),对红系分化影响不大;9、CRKL+CRKⅡ双敲降抑制Rac1的表达,而对ERK和p-ERK影响不大。结论:1、CRKL和CRKⅡ在CML初发患者骨髓样本中高表达,且CRKL表达水平高于CRKⅡ表达水平,在CR组中明显降低。CR组与正常组相比,CRKL表达下降而CRKⅡ无变化;2、CRKL下调通过激活Raf/MEK/ERK/Elk-1通路促进K562向红系分化,而CRKⅡ下调对K562红系分化无影响;3、CRKⅡ下调抑制K562体外增殖、迁移和侵袭能力;4、CRKⅡ通过p130Cas/CRK/Rac1信号通路调控K562的恶性生物学行为;5、CRKL+CRKⅡ双敲降进一步通过抑制Rac1表达抑制K562体外增殖、迁移和侵袭能力;6、CRKL+CRKⅡ通过p130Cas/CRK/Rac1通路调控K562细胞的增殖、迁移和侵袭能力。