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肺癌是全世界范围内最常见且发病率和致死率最高的恶性肿瘤。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)是肺癌的两种病理类型,其中非小细胞肺癌占85%左右。虽然临床上已联合应用手术、化疗、放疗等治疗方案,然而5年存活率依然不足15%。因此,深入研究肺癌的发病机制,寻找致病相关信号通路中潜在分子靶标,将为肺癌的诊断和治疗提供新的策略和切入点。WD重复蛋白是指包含4到16个WD重复结构域的蛋白。在真核生物中WD重复蛋白参与多种生命活动,比如信号转导、细胞分裂、细胞骨架组装、染色体组装、RNA代谢、细胞凋亡、细胞周期调控等等。WD重复结构域是一种N端以甘氨酸-组氨酸(GH)双肽起始,C端以色氨酸-天冬氨酸(WD)双肽结束的结构域,该结构域可以介导多种蛋白的相互作用。WD重复蛋白79(WD repeat protein 79,WDR79),又名WRAP53、TCAB1,为WD重复蛋白家族的重要成员,包含有6个WD重复结构域,从酵母到人类高度保守。研究表明WDR79作为脚手架蛋白参与端粒酶组装、卡哈尔体(Cajal body,CB)的形成、DNA双链损伤修复。除此之外,WDR79基因还编码一种p53基因的天然反义转录本(Wrap53a)并可稳定p53。目前已报道WDR79与多种疾病相关,如先天性角化不良综合症、鼻咽癌、食管鳞状细胞癌、结肠癌、ER阴性乳腺癌、卵巢癌等。然而,WDR79在非小细胞肺癌中的功能作用机制仍未阐明。本研究发现WDR79在NSCLC组织及细胞系中显著高表达并具有统计学意义,表明WDR79的表达很可能与NSCLC有关。为了明确WDR79在NSCLC中的生物学功能,构建了表达WDR79的-质粒以及靶向WDR79基因的shRNA慢病毒,通过MTT实验和克隆形成实验发现,下调WDR79的表达能够显著抑制H1299细胞的增殖,而过表达WDR79促进A549细胞的增殖。这些结果表明WDR79与NSCLC增殖密切相关。由于细胞增殖依赖于细胞周期的有序运行,因此,进一步探究了 WDR79对NSCLC细胞周期运行的影响。在A549细胞和H1299细胞中下调WDR79引起细胞周期阻滞在G0/G1期。通过检测G0/G1期相关的蛋白,发现WDR79诱导的细胞周期阻滞与G0/G1期相关的cyclin和CDK复合物的表达有关。由于细胞周期的阻滞常常导致细胞凋亡,为了明确WDR79是否影响细胞凋亡,通过在A549和H1299细胞中干扰WDR79的表达,通过检测细胞核形态和膜磷脂酰丝氨酸(PS)外翻的变化,结果发现下调WDR79诱导NSCLC细胞发生凋亡,其诱导凋亡的机制为通过线粒体途径:调控促凋亡蛋白Bcl-2和抑凋亡蛋白Bax的比例,促进细胞色素c从线粒体中释放,增强caspase-9和caspapse-3的活性。NSCLC移植瘤模型试验表明WDR79干扰导致细胞的移植瘤生长能力减弱。通过蛋白质功能结构域预测,发现WDR79蛋白上存在去泛素化酶USP7的多个结合位点,提示WDR79很可能与USP7存在相互作用。为了验证预测结果,采用间接免疫荧光共定位实验以及免疫共沉淀实验,明确WDR79和USP7在NSCLC细胞内存在相互作用。USP7作为细胞内重要的去泛素化酶,介导了 Mdm2-p53通路的调控。考虑到WDR79与USP7的相互作用,进一步检测了 WDR79对Mdm2和p53的影响。通过在NSCLC细胞中过表达WDR79,发现WDR79上调Mdm2和p53水平,而下调WDR79则减少Mdm2和p53水平。然而,real-time PCR检测显示WDR79对Mdm2和p53的mRNA水平没有影响,表明WDR79是在翻译后调控Mdm2和p53蛋白水平。通过放线菌酮抑制新生蛋白合成进一步发现WDR79干扰导致它们在细胞内的半衰期发生变化,说明调控发生在蛋白讲解途径中。细胞内翻译后蛋白的降解主要通过泛素-蛋白酶体通路,为了明确WDR79是否影响Mdm2和p53的泛素蛋白酶体降解,通过蛋白酶体抑制剂MG132实验,证明WDR79影响Mdm2和p53的泛素化和蛋白酶体降解。WDR79作为脚手架蛋白,并不具有任何酶的活性,通过在干扰USP7的细胞中过表达WDR79,我们证明WDR79对Mdm2和p53的影响依赖于USP7。进一步发现在USP7干扰的细胞系中,WDR79促细胞增殖的作用消失,表明WDR79通过USP7实现对Mdm2和p53的调控而促进NSCLC细胞增殖。为了系统的了解WDR79在非小细胞肺癌中的功能及机制,通过质谱分析技术发现WDR79干扰引起多种蛋白水平的改变,提示WDR79可能通过调控多种蛋白水平的改变而参与NF-kB、MAPK、Wnt、泛素-蛋白酶体降解、PI3K-Akt、cAMP等多种信号通路,并影响NSCLC的进程。综上所述,本研究首次阐明了 WDR79与NSCLC细胞增殖的关系。明确了WDR79通过与USP7的相互作用,参与调控Mdm2-p53信号通路,从而介导NSCLC细胞增殖的分子机制。系统揭示了 WDR79可能影响的信号转导通路网以及生物学过程。为针对WDR79开展NSCLC的临床诊断和靶向治疗提供理论基础和实验依据。