目的:无复流是目前临床PCI术后发生率较高的一种现象,与多种不良预后密切相关,可严重降低再灌注治疗效果。生长分化因子-15(Growth differential factor-15,GDF-15)作为转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族中的一员,不仅在细胞的生长、分化、增殖过程中发挥重要作用,而且与细胞的凋亡和死亡也有密切关系,参与多种病理生理过程,且与无复流现象密切相关,已成为国际研究热点。GDF-15在多种研究中被确认为一种应激反应性蛋白,可通过PI3K/Akt、ERK1/2等信号途径降低缺血再灌注损伤和炎症反应,发挥心脏保护作用。然而GDF-15是否可降低无复流损伤以及通过哪些靶分子降低无复流目前尚不清楚。ZNF580是由本组筛选人主动脉c DNA文库得到的一种新型C2H2锌指蛋白基因,ZFP580是本组随后克隆的人ZNF580的鼠源性同源基因。前期研究发现ZFP580作为一个重要的核转录因子,由ERK1/2信号通路介导从而减少心肌细胞凋亡,起到保护心脏的作用;且ZFP580可通过TGFβ/ALK5/Smad2通路调节e NOS表达和内皮细胞增殖、迁移,并参与H2O2诱导的ROS应激及炎症反应;ZFP580还可促进内皮祖细胞分化形成内皮细胞,促进其体外血管形成,在内皮细胞分化、成熟过程中发挥重要作用。那么GDF-15是否通过调控ZFP580/ZNF580表达进而降低缺血再灌注无复流损伤?本实验拟通过大鼠在体缺血再灌注无复流模型及脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)体外模拟缺血再灌注模型,探究ZFP580/ZNF580在GDF-15降低缺血再灌注无复流损伤中的作用及其机制。方法:1建立大鼠心脏缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)模型,结扎大鼠心脏左前降支1h,分别再灌注0h,0.5h,1h,2h,4h,检测不同再灌注时间点大鼠心脏无复流面积、梗死面积变化;ELISA检测动物血浆、心肌组织内GDF-15水平;2体外建立HUVECs模拟缺血再灌注(simulated I/R,s I/R)模型;MTT实验检测细胞活性,基质胶体外血管生成实验评价内皮细胞功能改变;3慢病毒转染使细胞内ZNF580过表达或干扰表达;Real-time PCR测定GDF-15、ZNF580/ZFP580和ICAM1的m RNA表达水平;Western Blot检测GDF-15、ZNF580/ZFP580、ERK1/2、p-ERK1/2、ICAM1的蛋白表达。结果:1大鼠心肌缺血再灌注后,心脏无复流、梗死发生率上升,且GDF-15和ZFP580的表达上调大鼠心脏缺血1h,再灌注不同时间点,sham(假手术)组只穿线不结扎。结果发现:除sham组,其他I/R组均有心电图异常改变和无复流、心肌梗死发生。各I/R组缺血范围无统计学差异,无复流及梗死现象发生。同时,实时定量RT-PCR和Western Blot的结果显示,缺血再灌注处理能在m RNA和蛋白水平刺激GDF-15和ZFP580的表达,各I/R组GDF-15、ZFP580表达水平均较sham组高,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA结果显示,各I/R组血浆和心肌组织内GDF-15水平均较sham组升高,差异有统计学意义(P<0.05)。2模拟缺血再灌注处理降低HUVECs活性并诱导GDF-15和ZNF580的表达HUVECs于缺氧罐内模拟缺血1h,而后模拟再灌注(0h,0.5h,1h,2h,4h),Control组不做处理。MTT结果显示:模拟缺血再灌注组细胞活性较Control组降低;RT-PCR和Western Blot的结果显示:GDF-15和ZNF580表达水平较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。3GDF-15显著诱导ZNF580表达,并降低模拟缺血再灌注影响给予HUVECs不同剂量(1,10,20,50,100ng/m L)GDF-15刺激1h,结果显示GDF-15刺激组的ZNF580表达量均较Control组升高,差异有统计学意义(P<0.05),且20ng/m L升高最为明显;再以20ng/m L GDF-15刺激不同时间(15min,30min,1h,2h,4h),结果显示1h时ZNF580表达量最高。故后续实验GDF-15刺激条件定为20ng/m L刺激1h。以此条件预刺激后模拟缺血再灌注,结果显示:GDF-15能在模拟缺血再灌注的基础上进一步促进ZNF580的表达,且可显著降低模拟缺血再灌注导致的ICAM1的高表达,同时可逆转模拟缺血再灌注导致的细胞活性降低和体外血管形成数目减少现象。4ZNF580在GDF-15降低模拟缺血再灌注影响中的重要作用转染慢病毒载体Lenti-ZNF580和Lent-si ZNF580使HUVECs内ZNF580过表达和干扰表达,转染空载病毒Lenti-NC和乱序载体Lenti-si-scrambled作为对照。实时定量RT-PCR和WB结果显示:Lenti-NC和Lenti-si-scrambled组ZNF580表达量与Control组无统计学差异;Lenti-ZNF580组ZNF580表达显著提高,Lent-si ZNF580组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。转染Lenti-si-scrambled、Lent-si ZNF580病毒的HUVECs经GDF-15预刺激后模拟缺血再灌注,发现干扰ZNF580表达后进一步提高s I/R造成的ICAM1高表达,进一步降低细胞活性和血管生成数目,而GDF-15预刺激组能一定程度消除上述影响而起到保护作用。过表达ZNF580能部分消除s I/R造成的ICAM1表达升高、细胞生存率降低和体外血管生成减少。5GDF-15通过ERK1/2通路调控ZNF580发挥降低模拟缺血再灌注后损伤作用根据文献报道和以往工作基础,我们进一步研究了GDF-15通过ERK1/2信号传导途径调控ZNF580在模拟缺血再灌注中的具体作用。WB结果表明:细胞预处理GDF-15后,p-ERK1/2表达量明显升高,有统计学意义(P<0.05),ERK1/2无明显变化。采用ERK1/2特异性阻滞剂PD98059阻断ERK1/2通路后,发现PD98059能一定程度降低GDF-15导致的ZNF580表达升高,并部分消除GDF-15降低模拟缺血再灌注损伤的作用。结论:大鼠心肌缺血再灌注后,GDF-15和ZFP580的表达上调且无复流、梗死发生率升高;GDF-15可显著减轻缺血再灌注损伤,且ZNF580参与其中,即GDF-15可通过调控ZNF580进而降低缺血再灌注损伤;ERK1/2作为细胞增殖、分化等作用的关键信号通路,参与GDF-15对ZNF580的表达调控。