奶牛乳腺炎是乳腺实质在受到各种病原菌感染及理化因素刺激下所发生的炎症反应。该病的主要特征是乳汁的理化特性和乳腺组织的病理变化,从而导致乳制品行业经济损失严重。因其存在诸如高昂的治疗费用和在牛场中的广泛流行等问题,严重影响了奶牛的福利和健康,甚至引起公共卫生问题。引起的奶牛乳腺炎最常见的致病菌是金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）。S.aureus作为兼性病原体,具有复杂的毒力因子库和容易产生抗生素耐药性的能力,这使它能在乳腺内存活和繁衍。持续性的乳房内感染一般表现为体细胞计数的长期增加和临床病例的反复出现,导致金黄色葡萄球菌性乳腺炎变得难以从牛群中彻底消除。自噬是受一系列信号通路和超过30种关键调节因子（自噬相关基因（Atgs））调控的细胞机制。异自噬做为细胞的“警卫员”通过清除胞内的病原体参与维持细胞机能。完整异自噬由三个步骤组成:自噬体的形成和成熟,自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体,自噬溶酶体降解病原体。而自噬最终发生生物学效应的关键是后两个步骤。值得关注的是,虽然目前有研究表明S.aureus能够入侵细胞并在细胞内存活。但是,关于S.aureus入侵细胞后自噬信号通路的激活、所引起自噬流的完整性和自噬与其胞内存活的关系都未见研究。因此,在明确S.aureus入侵细胞后激活自噬发生的信号通路后,通过分析自噬体成熟、自噬体和溶酶体融合和自噬溶酶体降解三个阶段的活化情况,找到S.aureus能够在细胞内存活所干扰的关键因素,最终以自噬标志蛋白LC3为核心筛选出S.aureus的黏附因子A（Clumping factor A,Clf A）,揭示Clf A干扰自噬体成熟以及引起自噬体和溶酶体融合障碍而躲避自噬降解的机制。主要研究内容包括以下三个部分:1.金黄色葡萄球菌诱导牛乳腺上皮细胞发生自噬的研究本章节的目的在于探索S.aureus侵入奶牛乳腺上皮细胞后激活的信号通路以及自噬对胞内S.aureus存活的影响。在此章节中,首先,构建S.aureus的细胞内感染模型。然后通过共聚焦显微镜和蛋白免疫印迹检测奶牛乳腺上皮细胞自噬的发生。同时,使用蛋白免疫印迹验证PI3K/Akt/m TOR和Erk1/2两条信号通路的激活水平。最后,通过使用自噬调节剂（3-甲基腺嘌呤、雷帕霉素、氯喹和LY3214996）分析胞内细菌和自噬之间的关系。结果表明,S.aureus确实能够入侵牛乳腺上皮细胞,且在持续感染细胞8 h内对细胞活性无影响。S.aureus在乳腺上皮细胞中显著诱导了自噬体的生成,并且在短时间内促进了LC3I/II转化和p62/SQSTM1降解,同时,PI3K-Akt-m TOR和Erk1/2信号通路在细胞内都被顺利激活。添加雷帕霉素诱导自噬后细胞内S.aureus数量增加,而添加氯喹抑制自噬后细胞内细菌的数量显著减少。因此,该研究表明细胞内S.aureus能诱导自噬体的产生,但不能被牛乳腺上皮细胞中的自噬消除,自噬体生成有利于S.aureus的胞内存活。2.金黄色葡萄球菌阻断自噬流逃避自噬清除的研究本章节旨在通过探究S.aureus入侵细胞后对自噬流不同阶段的影响,揭示S.aureus逃避自噬降解并存活的具体原因。在本章研究中,首先,构建胞内感染模型,使用透射电镜观察细胞内S.aureus的存活情况,通过蛋白免疫印迹和共聚焦显微镜检测自噬体的生成。其次,将S.aureus持续感染细胞8 h,运用蛋白免疫印迹检测期间LC3和p62水平的变化,通过共聚焦观察双标LC3的荧光变化,验证自噬体和溶酶体的融合情况。最后,通过共聚焦显微镜观察吖啶橙和溶酶体红色荧光探针的变化和蛋白免疫印迹检测LAMP2、CTSD和CTSL表达的变化,验证溶酶体酸性和降解功能的水平。结果表明,透射电镜观察到S.aureus在牛乳腺上皮细胞内清晰可见,并且S.aureus周围存在双层膜囊泡样结构,即诱导了自噬体的产生,自噬标志蛋白的免疫印迹分析和细胞荧光标记LC3法同样证实了这一点。同时,蛋白免疫印迹结果显示自噬标志蛋白LC3表达持续增加和p62蛋白降解受阻,瞬时转染双标LC3黄色荧光持续存在,S.aureus侵入细胞后自噬流明显受到抑制,且明显导致自噬体蓄积。此外,吖啶橙和红色溶酶体探针的红色荧光减弱、降解功能相关蛋白表达下降,即S.aureus感染细胞后导致了溶酶体的酸化能力和降解能力受损,说明S.aureus侵入细胞具有损伤溶酶体功能的能力。总之,这些结果表明,S.aureus侵入牛乳腺上皮细胞后通过抑制自噬通量和损伤溶酶体功能来逃避自噬的降解。3.金黄色葡萄球菌的Clf A干扰细胞自噬的研究本章节旨在以S.aureus入侵细胞后会引起自噬标志蛋白LC3过度蓄积为切入点,筛选出S.aureus能在自噬中逃逸的关键因子。在本章中,通过预测具有LC3识别基序的细菌蛋白,筛选到Clf A,它是S.aureus的纤维蛋白原（Fg）结合表面蛋白,属于一种与肽聚糖共价锚定的细胞壁定位蛋白。在引起皮下感染、脓毒血症、败血症和金黄色葡萄球菌肺炎等感染中发挥重要作用。首先,通过GST-pulldown试验检测Clf A和LC3能否互作,经在细胞内真核表达Clf A,通过蛋白免疫印迹和激光共聚焦检测Clf A和LC3在细胞内的关联性,随后,构建Clf A敲除株,并通过RNA和蛋白水平进行验证,经绘制细菌生长曲线和扫描电镜检测Clf A对细菌的影响。将野生株和敲除株分别感染细胞后进行转录组学和蛋白组学双组学分析,最后,对组学结果进行蛋白免疫印迹、活细胞成像和胞内载菌量等方面验证。结果证明,Clf A和LC3存在体外潜在互作。激光共聚焦观察到Clf A与LC3蛋白存在内源性互作关系。细菌生长曲线和扫描电镜证明Clf A对菌株生长无影响,仅影响细菌间的黏附力和进入细胞的效率。对比野生株与敲除株感染细胞后的转录组学与蛋白组学联合分析,证实Clf A通过与LC3结合干扰了多个自噬相关的细胞生物过程,包括PI3K-Akt-m TOR信号通路、自噬体成熟、自噬体和溶酶体融合等。最后,发现Clf A通过抑制自噬通量显著提高了S.aureus的胞内存活量。综上所述,S.aureus入侵细胞后,首先激活Akt/m TOR和Erk1/2两条信号通路诱导自噬发生,通过Clf A和自噬蛋白LC3靶向结合促进自噬体的形成,进而阻断自噬体和溶酶体融合以及破坏溶酶体降解能力,最终帮助S.aureus逃避自噬降解并在细胞内存活。本研究为Clf A对细菌感染的影响提供了新的见解,并有助于进一步阐明细菌与宿主免疫之间的关系。此外,了解Clf A相关免疫中的自噬途径对于预防或治疗S.aureus感染具有潜在的重要意义。