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第一部分脓毒症小鼠模型脾脏髓系来源免疫抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)的表型特征
研究目的：
髓系来源免疫抑制细胞是一群未成熟的异质性细胞，它有分化为树突细胞、巨噬细胞和粒细胞等的潜能，在小鼠中，共同的表面标记为Gr-1+CD11b+，具有很强的免疫抑制作用。MDSCs最初发现于肿瘤免疫当中，是促进肿瘤的血管生成，侵袭和转移的重要细胞群。近年来的研究表明，MDSCs在脓毒症免疫炎症反应的调控中发挥关键作用。而脓毒症病理状态下MDSCs是否具备经典肿瘤模型中的表型及功能特性，目前尚无报道，因此，本部分研究，首先从MDSCs的分布、表型、亚型、细胞形态等方面，比照肿瘤模型来源的经典MDSCs，阐述脓毒症中该细胞的特点。
研究方法：
采用经典盲肠结扎穿孔(CLP)小鼠脓毒症模型，造模7天后，断头处死小鼠，取脾脏；采用3LL和B16两种癌细胞系荷瘤的肿瘤模型，右下侧腹部皮下接种细胞2周后，荷瘤小鼠的肿瘤结节的直径达到2cm左右时，取脾脏备用。两种模型脾脏研磨，破红后，收集有核细胞，孵育相应抗体，采用流式细胞仪检测MDSCs以及其亚群、表型。用瑞氏吉姆萨染色法观察MDSCs的镜下形态。
研究结果：
MDSCs随脓毒症病程的进展在小鼠脾脏逐渐聚集。脓毒症来源的MDSCs与肿瘤来源的MDSCs一致，呈现出典型的环形核特点。MDSCs亚群：脓毒症模型小鼠的单核样MDSCs比例显著高于肿瘤模型(53.5%±9.4%vs29.25%±1.0%or28.7%±3.7%，**p＜0.01，n=3-5)；MDSCs表面标记物：脓毒症来源于肿瘤来源的MDSCs均表达CD115，CD34，CD11C和F4/80，而脓毒症组MDSCs的CD115的表达显著低于肿瘤组(24.5%±3.9%vs66.0%±10.0%or24.5%±3.9%vs48.7%±6.9%，n=3-7，**P＜0.01)。
研究结论：
脓毒症能够引起MDSCs在脾脏的聚集，其组化特征与肿瘤来源一致；相对于肿瘤模型，脓毒症模型来源的MDSCs的单核样MDSCs亚群比例增高；两种模型MDSCs均表达CD115，CD34，CD11C和F4/80等表面标记物，相对于肿瘤来源的MDSCs，脓毒症来源的细胞表面击落刺激因子受体CD115明显下降。
第二部分脓毒症小鼠模型脾脏髓系来源免疫抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)的功能学特征
研究目的：
免疫抑制是MDSCs的最主要功能，它涉及的机制：一方面，抑制T细胞为核心的获得性免疫功能，包括(1)产生大量的精氨酸酶和诱导型一氧化氮合酶，通过促进ROS和NO的产生而直接抑制T细胞的功能；(2)精氨酸是T细胞合成的重要氨基酸，MDSCs产生的精氨酸酶能够大量消耗精氨酸，导致T细胞信号转导发生障碍；(3)通过分泌IL-10、TGF-β等细胞抑制因子，诱导调节性T细胞(Treg)产生，从而发挥免疫抑制作用；另一方面，抑制巨噬细胞为核心的固有免疫功能，主要通过调控巨噬细胞M1/M2极化发生相互作用。本部分将从两方面入手，比照经典肿瘤来源的MDSCs，阐明脓毒症病理状态下MDSCs的功能学特点。
研究方法：
T细胞增殖实验：将1×106/ml细胞重悬于终浓度为2μM的CFSE染色液(无血清缓冲液)中，37℃水浴锅中小心震荡混匀，孵育5分钟，然后加入5-6倍的完全培养基中和反应，4℃300g离心，洗涤2次。调整细胞浓度，加入5μl/mlOVA(323-329)刺激，以不同浓度和MDSCs共培养于96孔板中。避光培养72小时后，收集细胞，经CD4-PE-CY5染色，流式检测分析。采用实时定量PCR测定ARG-1和iNOS表达。用ELISA检测细胞培养上清液中的IL-6和TGF-β水平。MDSCs与巨噬细胞接触性共培养，观察MDSCs对巨噬细胞极化的影响。腹腔注射的方法，过继回输细胞，观察小鼠生存率。
研究结果：
脓毒症模型来源的MDSCs对CD4+T细胞的抑制功能要明显弱于肿瘤组(n=3，*P＜0.05)。脓毒症来源的MDSCs给予脂多糖LPS刺激后，能分泌较多的IL-6促炎因子，而TGF-β因子水平则低于肿瘤组(n=3-4，**P＜0.01)。定量PCR结果显示，肿瘤组MDSCs的ARG-1基因水平表达较高，而iNOS的表达则没有统计学差异(n=3-5，*P＜0.05)。脓毒症来源的MDSCs诱导巨噬细胞向M1(F4/80+CD206-)分化，相反地，肿瘤来源的MDSCs则诱导向M2(F4/80+CD206+)分化。
研究结论：
脓毒症来源的免疫抑制细胞与肿瘤来源的相比，抑制T细胞为核心的获得性免疫功能较弱，而对于巨噬细胞为主的固有免疫，则呈现于肿瘤来源MDSCs截然相反的功能，且脓毒症病理状态下MDSCs，在LPS刺激后，分泌更多的促炎因子。
第三部分脓毒症小鼠模型来源髓系免疫抑制细胞(MDSCs)的编码mRNAs及长链非编码RNAs全基因组表达谱特征
研究目的：
前述结果首次表明，脓毒症来源MDSCs较经典肿瘤模模型MDSCs的表型及功能呈现显著性差异，为探究其内在机理，本部分研究收集小鼠脓毒症模型，肿瘤模型及na?ve状态的脾脏MDSCs，采用基因芯片，进行全基因mRNA检测；随着对非编码RNAs研究的深入，近些年发现以前被称之为“转录噪声”的长链非编码RNAs(Lnc RNAs)，参与了染色质的修饰、转录激活、转录干扰和核内运输等多种重要的调控过程。因此，同时进行了全基因组lncRNAs检测。比较二者MDSCs的异同，为今后深入阐述MDSCs表型及功能不同的机理，及探寻预警指标和免疫调控靶点提供依据。
研究方法：
小鼠盲肠结扎穿孔(CLP)和肿瘤模型。采用磁珠和流式细胞仪分选小鼠脾脏MDSCs。ArraystarRNA基因芯片对MDSCs的lncRNAs进行全基因检测，并对表达数据进行生物信息学分析，得到差异表达mRNAs及lncRNAs，DAVID进行GO分析，并用基因探针富集分析(GSEA)方法预测异常表达lncRNAs的靶向基因。
研究结果：
聚类分析显示，脓毒症模型来源MDSCs的mRNAs全基因组表达谱特征与肿瘤来源不同。以na?ve小鼠MDSCs为参照，log2表达变化差值≥1.5，p＜0.05为截点，脓毒症模型来源MDSCs有53个基因表达上调，而肿瘤模型来源的则有423个上调基因，其中41个为共同上调；脓毒症来源MDSCs有47个基因下调，而肿瘤来源的则有576个，其中22个为共同下调。差异基因KEGG-pathway分析显示，共同上调基因富集于Tolllikereceptor通路，GO分析显示与免疫，炎症等功能相关。而lncRNA聚类分析也显示，脓毒症模型来源MDSCs的mRNA全基因组表达特征与肿瘤来源不同。脓毒症模型来源MDSCs较na?veMDSCs有68个lncRNAs表达上调101个下调，比对Rinn研究组数据库，45.0%(76/169)的差异性lncRNAs属于基因间的lncRNAs。其中2个差异性lncRNAs进行GSEA分析显示其参与线粒体的功能和遗传信息处理相关基因表达的调控。
研究结论：
MDSCs的mRNAs及LncRNAs在脓毒症和肿瘤模型中呈现显著不同的特征，差异表达的mRNAs及lncRNAs生物信息学分析结果显示，其与MDSCs的一些重要功能密切相关，为深入机制和临床转化研究提供的靶点。
研究目的：
髓系来源免疫抑制细胞是一群未成熟的异质性细胞，它有分化为树突细胞、巨噬细胞和粒细胞等的潜能，在小鼠中，共同的表面标记为Gr-1+CD11b+，具有很强的免疫抑制作用。MDSCs最初发现于肿瘤免疫当中，是促进肿瘤的血管生成，侵袭和转移的重要细胞群。近年来的研究表明，MDSCs在脓毒症免疫炎症反应的调控中发挥关键作用。而脓毒症病理状态下MDSCs是否具备经典肿瘤模型中的表型及功能特性，目前尚无报道，因此，本部分研究，首先从MDSCs的分布、表型、亚型、细胞形态等方面，比照肿瘤模型来源的经典MDSCs，阐述脓毒症中该细胞的特点。
研究方法：
采用经典盲肠结扎穿孔(CLP)小鼠脓毒症模型，造模7天后，断头处死小鼠，取脾脏；采用3LL和B16两种癌细胞系荷瘤的肿瘤模型，右下侧腹部皮下接种细胞2周后，荷瘤小鼠的肿瘤结节的直径达到2cm左右时，取脾脏备用。两种模型脾脏研磨，破红后，收集有核细胞，孵育相应抗体，采用流式细胞仪检测MDSCs以及其亚群、表型。用瑞氏吉姆萨染色法观察MDSCs的镜下形态。
研究结果：
MDSCs随脓毒症病程的进展在小鼠脾脏逐渐聚集。脓毒症来源的MDSCs与肿瘤来源的MDSCs一致，呈现出典型的环形核特点。MDSCs亚群：脓毒症模型小鼠的单核样MDSCs比例显著高于肿瘤模型(53.5%±9.4%vs29.25%±1.0%or28.7%±3.7%，**p＜0.01，n=3-5)；MDSCs表面标记物：脓毒症来源于肿瘤来源的MDSCs均表达CD115，CD34，CD11C和F4/80，而脓毒症组MDSCs的CD115的表达显著低于肿瘤组(24.5%±3.9%vs66.0%±10.0%or24.5%±3.9%vs48.7%±6.9%，n=3-7，**P＜0.01)。
研究结论：
脓毒症能够引起MDSCs在脾脏的聚集，其组化特征与肿瘤来源一致；相对于肿瘤模型，脓毒症模型来源的MDSCs的单核样MDSCs亚群比例增高；两种模型MDSCs均表达CD115，CD34，CD11C和F4/80等表面标记物，相对于肿瘤来源的MDSCs，脓毒症来源的细胞表面击落刺激因子受体CD115明显下降。
第二部分脓毒症小鼠模型脾脏髓系来源免疫抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)的功能学特征
研究目的：
免疫抑制是MDSCs的最主要功能，它涉及的机制：一方面，抑制T细胞为核心的获得性免疫功能，包括(1)产生大量的精氨酸酶和诱导型一氧化氮合酶，通过促进ROS和NO的产生而直接抑制T细胞的功能；(2)精氨酸是T细胞合成的重要氨基酸，MDSCs产生的精氨酸酶能够大量消耗精氨酸，导致T细胞信号转导发生障碍；(3)通过分泌IL-10、TGF-β等细胞抑制因子，诱导调节性T细胞(Treg)产生，从而发挥免疫抑制作用；另一方面，抑制巨噬细胞为核心的固有免疫功能，主要通过调控巨噬细胞M1/M2极化发生相互作用。本部分将从两方面入手，比照经典肿瘤来源的MDSCs，阐明脓毒症病理状态下MDSCs的功能学特点。
研究方法：
T细胞增殖实验：将1×106/ml细胞重悬于终浓度为2μM的CFSE染色液(无血清缓冲液)中，37℃水浴锅中小心震荡混匀，孵育5分钟，然后加入5-6倍的完全培养基中和反应，4℃300g离心，洗涤2次。调整细胞浓度，加入5μl/mlOVA(323-329)刺激，以不同浓度和MDSCs共培养于96孔板中。避光培养72小时后，收集细胞，经CD4-PE-CY5染色，流式检测分析。采用实时定量PCR测定ARG-1和iNOS表达。用ELISA检测细胞培养上清液中的IL-6和TGF-β水平。MDSCs与巨噬细胞接触性共培养，观察MDSCs对巨噬细胞极化的影响。腹腔注射的方法，过继回输细胞，观察小鼠生存率。
研究结果：
脓毒症模型来源的MDSCs对CD4+T细胞的抑制功能要明显弱于肿瘤组(n=3，*P＜0.05)。脓毒症来源的MDSCs给予脂多糖LPS刺激后，能分泌较多的IL-6促炎因子，而TGF-β因子水平则低于肿瘤组(n=3-4，**P＜0.01)。定量PCR结果显示，肿瘤组MDSCs的ARG-1基因水平表达较高，而iNOS的表达则没有统计学差异(n=3-5，*P＜0.05)。脓毒症来源的MDSCs诱导巨噬细胞向M1(F4/80+CD206-)分化，相反地，肿瘤来源的MDSCs则诱导向M2(F4/80+CD206+)分化。
研究结论：
脓毒症来源的免疫抑制细胞与肿瘤来源的相比，抑制T细胞为核心的获得性免疫功能较弱，而对于巨噬细胞为主的固有免疫，则呈现于肿瘤来源MDSCs截然相反的功能，且脓毒症病理状态下MDSCs，在LPS刺激后，分泌更多的促炎因子。
第三部分脓毒症小鼠模型来源髓系免疫抑制细胞(MDSCs)的编码mRNAs及长链非编码RNAs全基因组表达谱特征
研究目的：
前述结果首次表明，脓毒症来源MDSCs较经典肿瘤模模型MDSCs的表型及功能呈现显著性差异，为探究其内在机理，本部分研究收集小鼠脓毒症模型，肿瘤模型及na?ve状态的脾脏MDSCs，采用基因芯片，进行全基因mRNA检测；随着对非编码RNAs研究的深入，近些年发现以前被称之为“转录噪声”的长链非编码RNAs(Lnc RNAs)，参与了染色质的修饰、转录激活、转录干扰和核内运输等多种重要的调控过程。因此，同时进行了全基因组lncRNAs检测。比较二者MDSCs的异同，为今后深入阐述MDSCs表型及功能不同的机理，及探寻预警指标和免疫调控靶点提供依据。
研究方法：
小鼠盲肠结扎穿孔(CLP)和肿瘤模型。采用磁珠和流式细胞仪分选小鼠脾脏MDSCs。ArraystarRNA基因芯片对MDSCs的lncRNAs进行全基因检测，并对表达数据进行生物信息学分析，得到差异表达mRNAs及lncRNAs，DAVID进行GO分析，并用基因探针富集分析(GSEA)方法预测异常表达lncRNAs的靶向基因。
研究结果：
聚类分析显示，脓毒症模型来源MDSCs的mRNAs全基因组表达谱特征与肿瘤来源不同。以na?ve小鼠MDSCs为参照，log2表达变化差值≥1.5，p＜0.05为截点，脓毒症模型来源MDSCs有53个基因表达上调，而肿瘤模型来源的则有423个上调基因，其中41个为共同上调；脓毒症来源MDSCs有47个基因下调，而肿瘤来源的则有576个，其中22个为共同下调。差异基因KEGG-pathway分析显示，共同上调基因富集于Tolllikereceptor通路，GO分析显示与免疫，炎症等功能相关。而lncRNA聚类分析也显示，脓毒症模型来源MDSCs的mRNA全基因组表达特征与肿瘤来源不同。脓毒症模型来源MDSCs较na?veMDSCs有68个lncRNAs表达上调101个下调，比对Rinn研究组数据库，45.0%(76/169)的差异性lncRNAs属于基因间的lncRNAs。其中2个差异性lncRNAs进行GSEA分析显示其参与线粒体的功能和遗传信息处理相关基因表达的调控。
研究结论：
MDSCs的mRNAs及LncRNAs在脓毒症和肿瘤模型中呈现显著不同的特征，差异表达的mRNAs及lncRNAs生物信息学分析结果显示，其与MDSCs的一些重要功能密切相关，为深入机制和临床转化研究提供的靶点。