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目的：研究紫苏醛（Perillaldehyde,PAE）在角膜抗真菌免疫中的作用及可能的分子机制。
方法：1、烟曲霉菌感染C57BL/6小鼠角膜，建立小鼠真菌性角膜炎动物模型，并将其随机分为溶剂对照组和紫苏醛处理组，在感染后第一天拆线并予小鼠6mM紫苏醛5ul结膜下注射，并用相同浓度紫苏醛每天三次点眼处理，用裂隙灯记录不同建模时间点各组小鼠角膜的情况，并观察感染不同时间点后溶剂对照组和药物处理组的小鼠角膜的临床评分。采用菌落计数法检测紫苏醛处理组与溶剂对照组小鼠角膜的活菌菌落数目。分别采用PCR和蛋白印迹法检测IL-1β、IL-6、TNF-α和Nrf2、HO-1和Dectin-1在损伤组、溶剂控制、紫苏醛处理组的小鼠角膜中的表达。2、用不同浓度紫苏醛（100uM、200uM、400uM、600uM）预处理永生化人角膜上皮细胞2h，然后用烟曲霉菌菌丝刺激，实时PCR检测人角膜上皮细胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α和Nrf2、HO-1、Dectin-1的表达，在感染后24h应用ELISA法检测人角膜上皮细胞中IL-6、IL-8和TNF-α的蛋白表达，应用免疫印迹法检测感染后8h角膜上皮细胞中Nrf2、HO-1的蛋白表达。应用免疫荧光法检测正常组和感染烟曲霉菌组的人角膜上皮细胞中Nrf2的表达及核转移现象。3、给予不同浓度紫苏醛（200uM、400uM）预处理永生化人角膜上皮细胞2h后，用Dectin-1配体凝胶多糖（Curdlan）刺激人角膜上皮细胞8h，采用Real-time PCR法检测各组人角膜上皮细胞促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α的基因表达，应用ELISA法检测各组24h的人角膜上皮细胞中促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α的蛋白表达，采用Western blot法检测各组感染后24h的人角膜上皮细胞中Dectin-1的蛋白表达。4、分别用Nrf2、HO-1的抑制剂Brusatol（BT）和ZnPP预处理永生化人角膜上皮细胞2h后加入600uM紫苏醛处理2h，加入烟曲霉菌刺激人角膜上皮细胞8h和24h，采用Real-time PCR法和ELISA法分别检测各组人角膜上皮细胞中IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA和蛋白表达，采用Western blot法检测各组8h人角膜上皮细胞的Nrf2和HO-1的蛋白表达。5、将不同浓度紫苏醛（0.2mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM、1.8mM）与烟曲霉菌孢子、溶剂对照与烟曲霉菌孢子置于液体琼脂培养基共培养24h、48h、72h、96h、120h后，将各时间点各组的混悬液加入96孔板中于540nM处检测吸光度，并采用真菌菌丝荧光染色方法观察48h各组菌丝生长状况。
结果：1、烟曲霉菌感染后3天和5天的小鼠角膜中，与溶剂对照组相比，紫苏醛处理组角膜混浊程度明显减轻，溃疡面积明显减小，角膜炎症的临床评分和角膜的菌落计数显著降低；紫苏醛处理组的感染角膜MPO水平较溶剂对照组显著降低，角膜免疫荧光显示紫苏醛能够减少由烟曲霉菌感染引起的角膜基质中中性粒细胞的募集。2、烟曲霉菌促进了人角膜上皮细胞中促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α）的mRNA和蛋白表达，紫苏醛预处理组能够显著抑制上述细胞因子的表达水平，呈浓度依赖性。3、在真菌感染3天和5天后的小鼠角膜中，紫苏醛处理组IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白水平较溶剂对照组显著降低。4、在永生化人角膜上皮细胞中，单纯紫苏醛预处理组Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白水平升高，烟曲霉菌刺激组人角膜上皮细胞Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白水平较正常对照组升高，而紫苏醛预处理进一步增加了烟曲霉菌诱导的Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白水平；在烟曲霉菌感染5天的小鼠角膜中，真菌使Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白水平增加，紫苏醛处理组进一步增加了烟曲霉菌诱导的Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白表达水平；免疫荧光结果表明，紫苏醛促进人角膜上皮细胞中的Nrf2从细胞质到细胞核的转移。5、应用BT（Nrf2抑制剂）和ZnPP（HO-1抑制剂）预处理角膜上皮细胞，Nrf2和HO-1蛋白水平较正常对照组减少，并且下调了紫苏醛诱导的Nrf2、HO-1表达水平；烟曲霉菌刺激使细胞中促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA和蛋白水平升高，紫苏醛预处理组上述炎症因子表达显著降低，而BT和ZnPP预处理组部分上调了紫苏醛抑制的上述炎症因子的mRNA和蛋白水平。6、与损伤对照组相比，烟曲霉菌感染显著增加了小鼠角膜中Dectin-1的mRNA和蛋白水平，而经紫苏醛处理的感染小鼠角膜中Dectin-1的表达显著低于溶剂对照组；单纯烟曲霉菌刺激人角膜上皮细胞后Dectin-1的mRNA水平升高，紫苏醛预处理明显降低了烟曲霉菌刺激引起的Dectin-1的mRNA水平；Curdlan预处理组人角膜上皮细胞中Dectin-1的蛋白水平较正常对照组升高，而紫苏醛预处理能够显著降低Curdlan诱导的Dectin-1的蛋白水平；Curdlan显著促进了人角膜上皮细胞中促炎细胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA和蛋白水平，而紫苏醛预处理的人角膜上皮细胞中上述细胞因子的mRNA和蛋白水平较单纯Curdlan刺激组明显降低，呈浓度依赖性。7、在体外将紫苏醛与烟曲霉菌孢子置于液体琼脂培养基共培养48h后，0.6mM紫苏醛处理组与溶剂对照组相比540nM处的吸光度显著降低，且随着药物浓度的增加，吸光度值逐渐降低，真菌菌丝荧光染色显示随着紫苏醛浓度增加，真菌菌丝和孢子的数量逐渐减少，当紫苏醛的浓度达到1.8mM时，未观察到有真菌菌丝和孢子存在。
结论：紫苏醛在真菌性角膜炎中同时发挥抗炎作用和抑真菌作用。紫苏醛可以通过激活Nrf2/HO-1信号通路、抑制Dectin-1介导的炎症反应及减少中性粒细胞的浸润来减轻真菌性角膜炎的炎症反应。此外，紫苏醛还可以通过抑制烟曲霉菌的生长减轻烟曲霉菌对角膜组织的损伤。
方法：1、烟曲霉菌感染C57BL/6小鼠角膜，建立小鼠真菌性角膜炎动物模型，并将其随机分为溶剂对照组和紫苏醛处理组，在感染后第一天拆线并予小鼠6mM紫苏醛5ul结膜下注射，并用相同浓度紫苏醛每天三次点眼处理，用裂隙灯记录不同建模时间点各组小鼠角膜的情况，并观察感染不同时间点后溶剂对照组和药物处理组的小鼠角膜的临床评分。采用菌落计数法检测紫苏醛处理组与溶剂对照组小鼠角膜的活菌菌落数目。分别采用PCR和蛋白印迹法检测IL-1β、IL-6、TNF-α和Nrf2、HO-1和Dectin-1在损伤组、溶剂控制、紫苏醛处理组的小鼠角膜中的表达。2、用不同浓度紫苏醛（100uM、200uM、400uM、600uM）预处理永生化人角膜上皮细胞2h，然后用烟曲霉菌菌丝刺激，实时PCR检测人角膜上皮细胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α和Nrf2、HO-1、Dectin-1的表达，在感染后24h应用ELISA法检测人角膜上皮细胞中IL-6、IL-8和TNF-α的蛋白表达，应用免疫印迹法检测感染后8h角膜上皮细胞中Nrf2、HO-1的蛋白表达。应用免疫荧光法检测正常组和感染烟曲霉菌组的人角膜上皮细胞中Nrf2的表达及核转移现象。3、给予不同浓度紫苏醛（200uM、400uM）预处理永生化人角膜上皮细胞2h后，用Dectin-1配体凝胶多糖（Curdlan）刺激人角膜上皮细胞8h，采用Real-time PCR法检测各组人角膜上皮细胞促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α的基因表达，应用ELISA法检测各组24h的人角膜上皮细胞中促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α的蛋白表达，采用Western blot法检测各组感染后24h的人角膜上皮细胞中Dectin-1的蛋白表达。4、分别用Nrf2、HO-1的抑制剂Brusatol（BT）和ZnPP预处理永生化人角膜上皮细胞2h后加入600uM紫苏醛处理2h，加入烟曲霉菌刺激人角膜上皮细胞8h和24h，采用Real-time PCR法和ELISA法分别检测各组人角膜上皮细胞中IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA和蛋白表达，采用Western blot法检测各组8h人角膜上皮细胞的Nrf2和HO-1的蛋白表达。5、将不同浓度紫苏醛（0.2mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM、1.8mM）与烟曲霉菌孢子、溶剂对照与烟曲霉菌孢子置于液体琼脂培养基共培养24h、48h、72h、96h、120h后，将各时间点各组的混悬液加入96孔板中于540nM处检测吸光度，并采用真菌菌丝荧光染色方法观察48h各组菌丝生长状况。
结果：1、烟曲霉菌感染后3天和5天的小鼠角膜中，与溶剂对照组相比，紫苏醛处理组角膜混浊程度明显减轻，溃疡面积明显减小，角膜炎症的临床评分和角膜的菌落计数显著降低；紫苏醛处理组的感染角膜MPO水平较溶剂对照组显著降低，角膜免疫荧光显示紫苏醛能够减少由烟曲霉菌感染引起的角膜基质中中性粒细胞的募集。2、烟曲霉菌促进了人角膜上皮细胞中促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α）的mRNA和蛋白表达，紫苏醛预处理组能够显著抑制上述细胞因子的表达水平，呈浓度依赖性。3、在真菌感染3天和5天后的小鼠角膜中，紫苏醛处理组IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白水平较溶剂对照组显著降低。4、在永生化人角膜上皮细胞中，单纯紫苏醛预处理组Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白水平升高，烟曲霉菌刺激组人角膜上皮细胞Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白水平较正常对照组升高，而紫苏醛预处理进一步增加了烟曲霉菌诱导的Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白水平；在烟曲霉菌感染5天的小鼠角膜中，真菌使Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白水平增加，紫苏醛处理组进一步增加了烟曲霉菌诱导的Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白表达水平；免疫荧光结果表明，紫苏醛促进人角膜上皮细胞中的Nrf2从细胞质到细胞核的转移。5、应用BT（Nrf2抑制剂）和ZnPP（HO-1抑制剂）预处理角膜上皮细胞，Nrf2和HO-1蛋白水平较正常对照组减少，并且下调了紫苏醛诱导的Nrf2、HO-1表达水平；烟曲霉菌刺激使细胞中促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA和蛋白水平升高，紫苏醛预处理组上述炎症因子表达显著降低，而BT和ZnPP预处理组部分上调了紫苏醛抑制的上述炎症因子的mRNA和蛋白水平。6、与损伤对照组相比，烟曲霉菌感染显著增加了小鼠角膜中Dectin-1的mRNA和蛋白水平，而经紫苏醛处理的感染小鼠角膜中Dectin-1的表达显著低于溶剂对照组；单纯烟曲霉菌刺激人角膜上皮细胞后Dectin-1的mRNA水平升高，紫苏醛预处理明显降低了烟曲霉菌刺激引起的Dectin-1的mRNA水平；Curdlan预处理组人角膜上皮细胞中Dectin-1的蛋白水平较正常对照组升高，而紫苏醛预处理能够显著降低Curdlan诱导的Dectin-1的蛋白水平；Curdlan显著促进了人角膜上皮细胞中促炎细胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA和蛋白水平，而紫苏醛预处理的人角膜上皮细胞中上述细胞因子的mRNA和蛋白水平较单纯Curdlan刺激组明显降低，呈浓度依赖性。7、在体外将紫苏醛与烟曲霉菌孢子置于液体琼脂培养基共培养48h后，0.6mM紫苏醛处理组与溶剂对照组相比540nM处的吸光度显著降低，且随着药物浓度的增加，吸光度值逐渐降低，真菌菌丝荧光染色显示随着紫苏醛浓度增加，真菌菌丝和孢子的数量逐渐减少，当紫苏醛的浓度达到1.8mM时，未观察到有真菌菌丝和孢子存在。
结论：紫苏醛在真菌性角膜炎中同时发挥抗炎作用和抑真菌作用。紫苏醛可以通过激活Nrf2/HO-1信号通路、抑制Dectin-1介导的炎症反应及减少中性粒细胞的浸润来减轻真菌性角膜炎的炎症反应。此外，紫苏醛还可以通过抑制烟曲霉菌的生长减轻烟曲霉菌对角膜组织的损伤。