【摘 要】
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GRAS蛋白是一类只在植物中发现的转录因子,参与如生长发育、植物激素信号转导以及非生物胁迫抗性等多种生物学功能。前期研究显示,盐穗木GRAS家族基因HcSCL13可显著提高转基因拟南芥在正常和盐胁下的生长,为明确转录因子HcSCL13的分子调节机制,我们分别对正常和125 m M Na Cl处理后的野生型和转基因拟南芥进行了转录组测序分析(RNA-seq)和挖掘,主要结果如下:(1)以|log2F
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GRAS蛋白是一类只在植物中发现的转录因子,参与如生长发育、植物激素信号转导以及非生物胁迫抗性等多种生物学功能。前期研究显示,盐穗木GRAS家族基因HcSCL13可显著提高转基因拟南芥在正常和盐胁下的生长,为明确转录因子HcSCL13的分子调节机制,我们分别对正常和125 m M Na Cl处理后的野生型和转基因拟南芥进行了转录组测序分析(RNA-seq)和挖掘,主要结果如下:(1)以|log2Fold Change|≥1,padj≤0.5为标准,转基因较野生型拟南芥在正常和125 m M Na Cl胁迫条件下的差异表达基因(DEGs)共328个,共差异基因11个。其中,正常条件下上调基因74个,盐胁迫条件下34个。通过q RT-PCR对部分DEGs进行表达分析检测,其差异表达变化与RNA-seq数据基本一致,提示该转录组数据结果可靠。进一步对上调差异表达基因进行GO富集和KEGG代谢通路分析,正常和盐胁迫条件下转基因拟南芥中的差异表达基因主要涉及代谢途径,次生代谢物的生物合成和植物激素信号转导,提示这可能是提高转基因拟南芥生长和盐胁迫耐受性的主要机制。(2)为进一步明确受HcSCL13直接调控的下游靶基因,基于差异表达的328个基因,我们发现其中共有51个转录因子。其中26个转录因子能够调控其它差异基因,并且部分转录因子之间也可相互调控,而MAF5却不参与调控其它的差异表达基因,也不受这些转录因子的调控,且MAF5在正常和盐胁迫条件下都持续性上调表达,因此,推测MAF5可能是HcSCL13直接调控的下游组分。为进一步明确二者的靶向关系,我们构建了含有HcSCL13基因的原核表达载体,通过对表达菌株诱导及纯化蛋白条件的探索,制备多克隆抗血清。结果显示,E.coli Rosetta为HcSCL13蛋白的最佳宿主表达菌,免疫兔子后获得了1:729000效价的多克隆抗体,利用正辛酸纯化抗体,Western Blot也显示出该抗体的特异性。同时我们扩增获得了拟南芥MAF5基因的上游启动子序列。以上结果,为利用染色质免疫共沉淀技术(Ch IP)验证HcSCL13转录因子与MAF5基因的靶向关系奠定了基础。
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