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本研究为广东省中医药强省建设专项中医优势病种突破项目(粤财社[2015]19号)、特应性皮炎临床和基础研究(粤财社[2011]572号)中的部分研究内容。课题组前期开发研制了具有健脾益气、抗炎止痒的培土清心颗粒(PTQX颗粒),初步建立具有明显皮损的小鼠模型,并验证了其在特应性皮炎(AD)中的临床疗效。本研究拟在前期研究基础上构建AD样小鼠模型和相关评价指标,观察PTQX颗粒对AD样小鼠模型免疫网络系统的影响。研究主要分为2部分。第一部分动物模型构建及评价体系的建立目的：参考国内外文献中特应性皮炎相关动物模型的造模方法,建立特应性皮炎样动物模型及相关评价体系。方法：1.以“特应性皮炎”、“AD”、“动物模型”等为检索词,查找相关文献数据库,根据文献质量评价进行数据提取和分析,参考国内外特应性皮炎动物模型中动物种属、性别选择及具体模型构建方法,筛选适宜的实验动物种属、动物性别和造模方法；2.模型建立后,综合迟发性超敏反应及慢性湿疹评价指标,采用皮损评分、行为观察记分、搔抓次数、耳廓厚度、皮肤病理、血清学等指标评价模型的病症特点。结果：1.国内外特应性皮炎样动物模型研究中,建立AD样动物模型的研究对象宜选用雌性C57BL/6或BALB/c小鼠,采用半抗原刺激诱导法造模,诱导药物采用2,4-硝基氟苯(DNFB)；2.与正常对照组比较,模型组小鼠背部皮损病理表现为明显角化过度、角化不全,棘层肥厚,表皮层、真皮浅层见明显炎性细胞浸润；血清中IgE、IL-4含量均明显升高(P<0.01),而IFN-γ未见明显变化(P>0.05)。3.造模结束后,模型组小鼠皮损评分、行为观察积分、搔抓次数、耳廓厚度等观察指标与正常组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。其中行为观察记分呈先升后降趋势,与同时点正常组比较,差异有统计学意义(P<0.05)；模型组小鼠搔抓次数明显上升、皮损评分、耳廓厚度显著增加(P<0.01)。结论：1.采用DNFB诱导法可成功建立AD样小鼠模型,所建立的AD样模型皮肤组织呈较典型慢性改变,血清学表现提示皮肤炎症表现以Th2型细胞为主；2.造模后模型组小鼠显示出较明显的慢性炎症性皮损,伴有瘙痒,与人类AD非常相像,其中皮损记分、瘙痒程度、耳廓厚度、组织病理及血清学改变等可作为判断该模型成功与否的重要依据。第二部分PTQX颗粒对AD样小鼠的免疫调控机制研究目的：通过PTQX颗粒干预AD样小鼠模型,从模型构建影响、血清和皮损细胞因子变化、脾脏Breg细胞数量变化等方面探讨其影响AD免疫调控的可能机制。方法：1.将雌性C57BL/6小鼠随机分为4组,即正常组、模型组、PTQX高剂量组(临床2倍剂量,PTQX颗粒1.56g/kg·d)、PTQX低剂量组(临床等效剂量,PTQX颗粒0.78g/kg·d)。各组小鼠给药方式是灌胃,培土清心用药组用不同浓度水溶液灌胃,正常组和模型组同法给予等体积的蒸馏水,造模第一天开始用药,连续给药14天；实验第1天、第7天、第14天观察各组小鼠行为观察记分、搔抓次数、皮损评分、耳廓厚度等指标；2.采用DNFB反复刺激诱导方法造模,造模前备皮(大小约2.5cm×1.5cm)。造模第一天背部外涂0.5%DNFB溶液25μl致敏,其后第5天、第8天、第11天、第14天在小鼠右耳背面、背部外涂0.2%的DNFB溶液20μl诱发皮炎,左耳外涂基质溶液20μl作对照组；实验结束48小时内予眼球摘除法处死,取背部皮损处全层皮肤做皮肤常规病理和肥大细胞计数变化(甲苯胺蓝染色)；3.采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠血清中IgE的含量,液相芯片法测定血清中IFN-γ、IL-4、IL-10的含量；4.提取小鼠背部皮肤组织中总RNA,并鉴定其浓度和纯度,采用定量即时聚合酶链式反应(Q-PCR)扩增后检测其皮肤组织中IFN-γ、IL-4、IL-10 mRNA表达水平；5.取小鼠脾脏,分离并培养脾脏淋巴细胞,处理后采用流式细胞术检测脾脏细胞中调节性B细胞(Breg)水平数量及变化。结果：1.造模结束后,模型组小鼠搔抓次数、皮损评分、耳廓厚度较正常组明显升高(P<0.01),给予PTQX颗粒后,小鼠搔抓次数、皮损评分、耳廓厚度均明显降低(P<0.01)；行为观察记分趋向于正常,与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)；皮肤组织病理棘层肥厚较模型组减轻,皮肤炎性细胞浸润减少,肥大细胞计数明显降低(P<0.01)；2.与正常对照组比较,模型组小鼠血清IgE、IL-4含量增加(P<0.01),血清IFN-γ、IL-10未见明显改变(P>0.05),给予PTQX颗粒后,PTQX高剂量组与PTQX低剂量组小鼠血清中IgE含量均明显降低(P<0.05),PTQX低剂量组小鼠血清中IL-4含量与模型组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),PTQX高剂量组血清中IL-4含量与模型组比较呈下降趋势;两组用药组小鼠血清中IFN-γ、IL-10含量与模型组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)；3.Q-PCR结果显示造模后,小鼠皮肤组织的i110 mRNA、ifnγ mRNA、i14 mRNA表达量均上升。给予PTQX颗粒后,不同剂量用药组ifnγ mRNA、il4 mRNA表达量均减少,与模型组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05),而小鼠皮肤组织i110mRNA表达量在PTQX颗粒干预后明显升高,与模型组比较差异明显(P<0.05)。4.造模后,小鼠脾脏内CD5+B淋巴细胞整体数量所占淋巴细胞的比率明显下降(P<0.01),给予PTQX颗粒后,PTQX高剂量组和PTQX低剂量组CD5+B淋巴细胞较模型组明显升高(P<0.05),趋向于正常。而造模后小鼠脾脏内CD4+T淋巴细胞、CD4+IL-4+T淋巴细胞、CD4+IFN-γ+T淋巴细胞、CD4+IL-17+T淋巴细胞、CD5+CD19+淋巴细胞、CD5+CDld+B淋巴细胞、Breg细胞阳性表达率均未见明显改变,给予PTQX颗粒后,PTQX高剂量组CD5+CD1d+B淋巴细胞阳性表达率明显增多(P<0.05),而低剂量组呈增多趋势(P>0.05)；PTQX高剂量组Breg细胞阳性表达率明显升高,与模型组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),而低剂量组呈增多趋势(P>0.05),其余淋巴细胞阳性表达率与与模型组比较,差异也均无统计学意义(P>0.05)。结论：1.PTQX颗粒可有效改善AD样小鼠模型皮损情况,减轻瘙痒,减少皮肤炎性细胞浸润；2.IgE、IFN-γ、IL-4、IL-10是培土清心颗粒干预AD的重要靶点,PTQX颗粒治疗AD可能与下调血清IgE、IL-4含量和皮肤中ifnγ mRNA、il4mRNA含量,上调i110mRNA含量有关,通过纠正上述细胞因子紊乱、恢复体内免疫稳态而发挥治疗作用；3.PTQX颗粒可能通过刺激CD5‘B淋巴细胞、CD5+CDld+B淋巴细胞、Breg细胞增殖,调节特应性皮炎患者免疫失衡状态。