SNCG真核表达载体构建及其在胶质瘤细胞中的稳定表达和影响

来源 :天津医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ellen
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
目的:胶质瘤发生、发展过程中有着众多基因参与其中,它们以复杂的网络形式相互作用,基因是这个网络中最基本的单元。从基因层面上对胶质瘤的研究,对于进一步了解胶质瘤的发病机制、以及疾病进程有着根本上的帮助。研究胶质瘤中某种基因的变化规律,对于提供评估胶质瘤的诊断、预后以及治疗靶点有着重大的意义。通过建立神经突触核蛋白-γ(SNCG)真核表达载体,随后利用SNCG真核表达载体来构建稳定过表达SNCG模型的人胶质瘤U373细胞,从基因、细胞周期及药物干预三个方面,初步探讨过表达SNCG对U373细胞的影响。方法:参照GenBank数据库(NM 003087),用Primer 5.0软件设计SNCG扩增用引物。随后以质粒pcDNA3-SNCG为模板,应用RT-PCR法扩增SNCG基因,对扩增的DNA片段进行纯化回收,将纯化回收产物与真核表达载体pIRES2-EGFP进行双酶切,经电泳后回收目的条带,用T4 DNA连接酶将目的片段和空载体进行连接,用DH5α感受态大肠杆菌转化,将转化细菌均匀涂布于含卡那霉素50mg/L的LB琼脂平板,37℃倒置培养12h,待长出抗性菌落后挑取单菌落转移至液体培养基中摇动培养。按质粒小提试剂盒说明书提取质粒后,以重组质粒为模板进行质粒PCR扩增鉴定。再用BamHI和EcoRI进行双酶切鉴定。重组菌液送交上海Invitrogen生物公司测序,将测序结果正确的重组质粒命名为pIRES2-EGFP-SNCG。通过EcoRI、BamH I双酶切及测序鉴定正确后转染至人神经胶质瘤细胞U373,G418筛选建立SNCG稳定转染的U373细胞系。运用免疫荧光以及实时定量PCR(real-time RT-PCR)检测转染后SNCG表达,流式细胞术(FCM)检测SNCG对细胞周期的影响。结果:经RT-PCR验证以及通过pIRES2-EGFP载体多克隆位点上的通用引物进行双向测序鉴定,DNA测序结果证实重组质粒插入片段SNCG的序列与GenBank公布序列一致,重组SNCG真核表达载体构建正确。即成功构建了pIRES2-EGFP-SNCG真核表达载体,建立稳定转染SNCG的U373细胞系。重组质粒pIRES2-EGFP-SNCG稳定转染U373细胞后,荧光显微镜观察同一视野细胞,可见视野中细胞均呈现绿色荧光。RT-PCR检测结果显示,与未转染U373细胞比较,U373/neo和U373/SNCG细胞的neo mRNA表达均显著升高;U373/SNCG细胞的SNCG mRNA表达水平显著升高,而未转染U373细胞和U373/neo细胞间无差别。与U373/neo细胞相比,U373/SNCG细胞SNCG mRNA表达上调17倍:经紫杉醇(PTX)处理后,U373/SNCG细胞G2/M比例(49±3.6)%较U373/neo细胞(66±1.7)%下降17%(P<0.05)。结论:成功构建了人SNCG真核表达载体,并在U373细胞中稳定过表达,初步证实过表达SNCG可降低抗微管药物诱导的U373细胞有丝分裂期阻滞,为进一步体外研究SNCG在神经胶质瘤侵袭及转移中的功能奠定了基础,以及为胶质瘤的诊断及治疗提供新的思路。在临床上对SNCG作为胶质瘤血清及体液标志物和化疗耐药机制的应用价值进一步进行检验,可能成为控制肿瘤耐药和新型抗肿瘤药物研发的新策略。
其他文献
米歇尔&#183;图尼埃和朱利安&#183;格拉克,同为法国现代文学史上的著名大师,前者被誉为“新寓言派”代表作家,后者则被认为是“超现实主义”在严肃文学界的代表。他们看似具
介绍了国内外热冲压模具钢的主要产品和市场现状,简述了热冲压模具钢的性能要求、失效形式和合金化特点。通过对近年来国内外热冲压模具钢研究现状和发展动态的阐述,预测热冲
党的十八大以来,习近平总书记高度重视依法治国和法治中国的建设,党的十八届四中全会通过的《关于全面推进依法治国若干问题的决定》明确提出了,“建设中国特色社会主义法治体系
报纸
走马灯是中国的文化瑰宝,但在现今生活中却很少能见其身影,主要是因为其与当代人的生活方式理念契合度低,所以需对走马灯的设计进行改良,对其设计思维进行有机的提取,使传统
现代性是一个相当庞杂和宽泛的概念,它面对中国现代文学史上某些作家的时候,也会出现尴尬失语的处境,如废名、沈从文等。因为,从这类作家创作中所体现出的精神向度及思想倾向
近期对于镀锌行业生产情况调研显示,11月份镀锌行业开工率为74%,环比下降3%。调研的镀锌厂家共113家,主要是镀锌板卷、镀锌管以及镀锌铁塔生产企业。地域分布主要是镀锌生产集中的
目的:探讨Twist在鼻咽癌中的表达情况及临床意义。研究方法:采用免疫组化法检测83例鼻咽癌和18例鼻咽部炎性组织中Twist的表达。对鼻咽癌组织中Twist的表达与临床病理因素及预
<正> 目前聚氯乙烯悬浮聚合生产中,做为引发剂使用的主要有三种类型: 低效引发剂: 偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈 中效引发剂: BPPD(过氧化二碳酸二苯氧乙基酯) 高效引发剂: DC
本刊讯,当地时间4月12日下午,赞比亚穆富利拉尾矿库合作开发协议正式签约。根据协议,中国有色集团出资企业谦比希湿法冶炼有限公司(简称湿法公司)将利用自身湿法冶炼的技术优势,首