高质量水溶性量子点的制备及生物应用

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胶体半导体纳米晶(量子点)由于其独特的物理、化学尺寸依赖性以及优异的溶液可操作性正得到广大科研人员的关注。这些特点使得量子点在很多领域例如光电器件、光伏电池、催化以及生物医学等领域拥有很多的潜在应用价值。其中量子点作为一种新型荧光材料应用于以检测荧光信号为基础的生物标识正蓬勃发展,包括生物分子检测、生物细胞标记以及生物体内的荧光成像等。量子点实现生物应用,首要前提是能够在水溶液中分散,此外还需要具备高荧光效率、高稳定性,这些条件是制约量子点生物应用的主要障碍。本论文主要研究在油相制备和水相制备的量子点表面进行SiO2包覆,以及在水相中使用双配体直接制备水溶性量子点的方法,使量子点能够稳定分散在水溶液中,并使量子点具有很高的荧光效率及稳定性。制备的量子点进行细胞标记成像应用,及利用荧光共振能量转移(FRET)原理检测DNA甲基化等的生物应用,并取得了很好的成像标记和检测效果。具体研究内容如下:  (1)高质量SiO2包覆的水溶性量子点的制备及细胞成像应用  采用St(o)ber法在量子点表面包覆二氧化硅层是一种有效地使荧光量子点具有水溶性、生物相容性和低毒性的方法。然而,应用这种方法的主要障碍是如何得到能够在乙醇溶液中分散的高荧光,高稳定性量子点。本文中,我们报道了一种以St(o)ber法为前提的简易方法合成高荧光,尺寸可控和高稳定性的硅包覆量子点。在二氧化硅包覆之前,最初的油溶性量子点首先通过腺苷-5磷酸(AMP)分子进行配体交换得到能够在醇溶液中均匀分散的AMP包裹的量子点(AMP-QDs)。然后,3-巯异丙基三甲氧基硅烷(MPS)作为硅前驱物加入到AMP-QDs乙醇溶液体系中生成一层薄的硅层,为后续厚壳的形成提供成核位点。最后通过正硅酸乙酯(TEOS)的水解在量子点表面形成可控厚度的硅壳。制备的QD@SiO2能够维持最初油溶性量子点的高荧光效率(50-65%),而且具有优异的光和胶体稳定性,在pH=3-13范围,高盐浓度(高达4M),以及高温100℃环境下都能长时间稳定存在。此外,硅壳的形成能够有效地抑制量子点的毒性。量子点表面嫁接叶酸分子后,能够特异性地识别叶酸阳性受体Hela细胞和阴性受体A549细胞,说明制备的QD@SiO2能够作为荧光标记物应用于生物成像中。  (2)水溶性量子点表面包覆SiO2及细胞成像应用  二氧化硅包覆技术是一种使荧光量子点具有水溶性和生物相容性的有效方法。然而目前制备高荧光亮度,小尺寸,高稳定性的二氧化硅包覆的量子点(QD@SiO2)依然是一个很大的挑战。本文中我们报道了一种改进的St(o)ber法,在水相合成的CdTe/CdS量子点表面进行二氧化硅包覆。向CdTe/CdS量子点水溶液中加入Cd2+和巯基乙酸(TGA),然后通过正硅酸乙酯(TEOS)的水解在量子点表面生成薄层硅壳。该途径制备的QD@SiO2具有很小的尺寸(直径约5nm),而且和未包覆硅层的量子点相比具有更高的荧光效率。此外,QD@SiO2还具有优异的光和胶体稳定性(pH=5-13范围,4.0M氯化钠溶液中稳定存在)。由于硅壳的形成,量子点的毒性得到有效抑制。QD@SiO2通过与叶酸(FA)分子的连接,能够特异性地标记叶酸阳性受体肿瘤Hela细胞。  (3)双配体水相介质合成CdTe/CdS核/壳量子点  水相介质中直接合成量子点通常会遇到低的荧光效率以及光和胶体稳定性问题,而导致该问题的主要原因是量子点表面包覆的水溶性配体分子。单磷酸腺苷(AMP)由于其表面具有多个可以与金属离子螯合的位点,所以是一种很有前景的量子点表面包覆配体。本文中,我们采用腺苷-5磷酸(AMP)和巯基丙酸(MPA)两种配体协同包覆在量子点表面,直接水相介质中合成了高质量的CdTe/CdS核/壳结构量子点。通过两种配体的协同作用,我们发现双配体可以加快反应速度,同时合成的量子点具有很高的荧光量子产率,而且制备的CdTe/CdS核/壳量子点具有窄的颗粒尺寸分布和近似球形的形态。最重要的是,合成的AMP/MPA-QDs具有优异的光和胶体稳定性,对量子点的生物应用起到了至关重要的作用。本文中,制备的量子点通过连接叶酸分子,成功应用在肿瘤细胞的标记成像中。  (4)基于量子点共振能量转移检测DNA甲基化  DNA甲基化是表观遗传学的一部分,其与人类基因表达和细胞可塑性息息相关,因而被科研工作者广泛研究。在人类癌症研究中,DNA甲基化的异常变化是普遍存在的,这些异常变化的检测逐渐成为癌症诊断的重要信息。本文中,我们报道了一种以量子点为基础的荧光共振能量转移(FRET)技术检测DNA甲基化。这种方法是建立在甲基化敏感限制性内切酶对基因组DNA甲基化位点酶切能力的不同来判断临床样本甲基化程度。被酶切的DNA经过PCR扩增引入Alexa-647(A647)荧光团。DNA甲基化程度可以通过凝胶电泳实现定性分析,也可以通过PCR产物中加入量子点产生与A647之间的FRET信号来实现定量检测。我们试验了三种潜在的肿瘤表达基因(PCDHGB6,HOXA9和RASSF1A)在20对肺腺癌和癌旁组织样本中的甲基化程度来证明建立的方法的可行性。实验结果得到了很高的检测灵敏度(90%)。我们建立的以量子点为基础的FRET法是一种简便的、定量的、以及高通量的方法,期望可以作为一种有效实用的方法用于人类某些癌症的诊断。
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