论文部分内容阅读
鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌引起的鸭、鹅、火鸡等多种禽类的一种细菌性传染病。血清型众多、交叉保护力低、易产生耐药性使该病难以防控。因此,加强对鸭疫里氏杆菌致病机制的研究对防制该病具有重要意义。Por分泌系统（Por secretion system,Por SS）,也称为Ⅸ型分泌系统（T9SS）。广泛分布于拟杆菌门成员中,介导拟杆菌门细菌的运动性及致病机制。生物信息学分析发现RA-YM株基因组存在完整的Por SS系统编码基因。sprT基因是Por SS系统关键组件。因此,本研究构建了RA-YM株sprT基因（RAYM03924）缺失株,对缺失株生物学特性开展了研究,具体研究内容如下:1、鸭疫里氏杆菌RA-YM株sprT基因缺失株的构建与鉴定以RA-YM株基因组为模板,扩增sprT基因上、下游同源臂,利用重叠PCR方法将上、下游同源臂与壮观霉素基因融合,构建壮观霉素抗性基因表达盒,经双酶切后与p RE-112连接,构建自杀性质粒p RE-LSR。将构建成功的自杀性质粒p RE-LSR转化E.coli X7213,以含有p RE-LSR的E.coli X7213为供体菌,以RA-YM株为受体菌,采取双亲本接合转移的方法筛选sprT基因缺失株。挑取在含有壮观霉素的TSA平板上生长的单菌落,利用双重PCR鉴定sprT基因缺失突变株,成功构建了RA-YM株sprT基因缺失株ΔsprT。2、鸭疫里氏杆菌RA-YM株sprT基因缺失株生物学特性研究比较了突变株ΔsprT与亲本株RA-YM的生长特性和生化特性,结果显示ΔsprT在对数早期的生长速度快于RA-YM,ΔsprT和RA-YM主要生化特性一致,但ΔsprT不能液化明胶。突变株ΔsprT和RA-YM对高盐耐受浓度一致,均为1.88%。ΔsprT对胆盐的耐受浓度为23.4μg/m L,RA-YM对胆盐的耐受浓度为46.9μg/m L。血清抗性试验结果显示,突变株ΔsprT在12.5%正常鸭阴性血请的存活率显著高于RA-YM。对突变株ΔsprT和亲本株胞外分泌蛋白的明胶酶谱分析发现,ΔsprT不能够分泌明胶酶,表明sprT基因缺失导致某些蛋白分泌障碍。3、鸭疫里氏杆菌RA-YM株sprT基因缺失株对雏鸭致病性的研究比较了ΔsprT与RA-YM对10日龄雏鸭的毒力,经腿部肌肉注射感染,RA-YM株LD50为3.82×104CFU,ΔsprT株LD50为1.61×109CFU,毒力较亲本株下降约4.21×104倍;雏鸭感染试验结果显示,在感染后24h,ΔsprT在血液、肝脏、和脾脏的组织载菌量显著低于RA-YM;在感染后48h,ΔsprT在心脏、肝脏、脾脏和脑的组织载菌量显著低于RA-YM,表明ΔsprT对组织的侵袭力比亲本株下降;病理切片观察发现,ΔsprT对心脏,肝脏、脾脏和脑组织的病变程度显著比亲本株轻微,表明ΔsprT的致病性较RA-YM显著下降。本研究发现sprT基因缺失突变后致其毒力显著下降,表明通过Por SS系统分泌的因子是鸭疫里氏杆菌重要的毒力因子,值得进一步深入研究。