论文部分内容阅读
研究目的:维甲酸(RA)是一组视黄醇(即维生素A)的活性分子衍生物,是目前临床上应用最为成功的分化诱导剂,可通过与维甲酸受体特别是维甲酸受体alpha(RARtα)结合,引起细胞周期蛋白依赖性激酶活化激酶(CAK)与RARα的解离,导致RARα的低磷酸化,从而达到诱导人急性髓性白血病细胞分化或凋亡的作用。在这一分子过程的基础上,本文进一步探讨CAK-RARα通路在维甲酸诱导的骨肉瘤细胞、造血干细胞粒性分化和急性T淋巴细胞凋亡的调控作用。研究方法:1)选用人骨肉瘤细胞U2OS和MG63为研究对象,以全反式维甲酸(ATRA)处理或采用慢病毒转染法导入低磷酸化的RARα,来评价ATRA诱导的RARα低磷酸化与诱导骨肉瘤细胞分化之间的相关性;采用台盼兰拒染法检测活细胞数量,并采用血细胞计数板计数来观察细胞增殖情况,描绘细胞生长曲线;细胞经碘化丙锭(PI)染色后采用流式细胞术分析细胞周期的变化情况;应用RT-PCR和Western blot检测骨肉瘤细胞分化标记基因转录水平和蛋白表达水平;采用Western blot检测细胞周期相关蛋白CDK7、p27、p21的表达;结合基因芯片技术检测RA及外源性低磷酸化RARα作用下人骨肉瘤细胞相关基因的变化。2)选用人造血干细胞(HSC)、髓性前体细胞(CMP)和髓性/粒性前体细胞(GMP)经RA作用或是采用慢病毒转染法导入低磷酸化的RARα,观察低磷酸化RARα与上述细胞分化之间的关系;应用台盼兰拒染法结合血细胞计数板计数,观察药物对细胞增殖情况的影响;吉姆萨染色观察药物作用后细胞形态学改变;采用RT-PCR和Western Blot检测ATRA诱导HSC,CMP,GMP和人造血干细胞CD34+细胞分化的相关基因转录和蛋白表达情况;应用细胞免疫荧光检测MAT1和CAK-RARα通路相关蛋白在分化各阶段的表达;结合免疫沉淀检测分化各个阶段血细胞CAK-RARα通路蛋白之间相互作用的关系。3)选用人急性T淋巴Molt3细胞为研究对象,RA作用,采用台盼兰拒染法结合血细胞计数板计数,观察其对细胞增殖情况的影响;采用PI染色,流式细胞术分析细胞凋亡;应用Western blot技术检测细胞凋亡的相关蛋白caspase-3、PARP、BCL-2、BAX的表达;应用RT-PCR和Westernblot技术检测RARα和p21的基因转录和蛋白表达。研究结果:1)通过台盼兰拒染法和血细胞计数板计数,显示ATRA(5μM)可显著抑制U2OS和MG63细胞增殖。流式细胞术分析细胞周期情况,显示ATRA(5μM)能使人骨肉瘤细胞的细胞周期阻滞在G1/G0期。同时,通过Western blot技术检测相关周期蛋白,发现ATRA(5μM)能降低U2OS和MG63细胞中CDK7和p21的表达,引起P27的上调。该浓度的ATRA也能诱导人骨肉瘤细胞分化标记物OPN的基因转录和蛋白表达增加,显示ATRA可诱导骨肉瘤细胞分化。通过基因芯片比较ATRA诱导分化细胞与空白对照细胞的基因表达谱,推测ATRA诱导骨肉瘤分化可能与RARα、RARβ、BMP、WNT和FGF蛋白有关。2)通过台盼兰拒染法和血细胞计数板计数及吉姆萨染色显示ATRA(1μM)能抑制分化各个阶段造血干细胞HSC、CMP和GMP细胞的增殖,增加三者的粒性分化。通过免疫荧光和Western blot技术确定了CAK-RARα通路上pRb、MAT1、CDK7和RAR RARαα在分化各个阶段造血干细胞HSC、CMP和GMP细胞中的表达情况,从中显示MAT1的表达随着粒性分化的成熟而降解,在HSC中表达最高、CMP次之,GMP最低。ATRA(1μM)诱导CMP细胞粒性分化过程中,CDK7和RARα的表达增加,P21的表达下降,同时pRb,CDK7及RARα的磷酸化水平都发生下调。结合免疫沉淀技术还可见ATRA(1μM)促进的CMP和GMP细胞粒性分化时,可使CAK-RARα复合体的解离,CMP细胞在粒性分化过程中还伴随着RARα和CDK7表达的下调,GMP细胞则伴随着MAT1的降解。3)通过慢病毒转染法,血细胞计数板计数,RT-PCR和Western Blot显示外源性低磷酸化的RARα能显著抑制人骨肉瘤细胞增殖,并能增加RA诱导分化的能力。结合基因芯片技术,比较了导入外源性低磷酸化RARα所上调的基因与全反式维甲酸作用所上调的基因。导入外源性低磷酸化RARα的U2OS细胞较空白对照细胞共有4个维甲酸受体相关通路基因显著上调。在成骨细胞分化相关通路基因中,U2OS细胞导入外源性RARαS77A后有18个基因显著上调,这一结果与全反式维甲酸诱导分化的人骨肉瘤细胞相似。对细胞因子类差异基因进行生物信息学分析表明,导入外源性RARαS77A后有20个基因显著上调。4)通过慢病毒转染法,血细胞计数板计数及吉姆萨染色显示显示外源性低磷酸化的RARα能显著抑制人CD34+细胞增殖,并能增加ATRA诱导分化的能力。通过RT-PCR可见外源性低磷酸化的RARα增加ATRA诱导的CD34+细胞中p21mRNA的水平。5)通过血细胞计数板计数可见ATRA(5μM)显著抑制Molt3细胞增殖。通过台盼兰拒染法和流式细胞术可见ATRA(5μM)处理Molt3细胞在抑制细胞增殖的同时引起了细胞的死亡。通过Western Blot可见ATRA(5μM)可使caspase 3发生裂解,激活的Caspase 3促进PARP发生水解,产生裂解片段。同时ATRA(5μM)可以抑制Molt3细胞中BCL-2的表达,促进BAX的表达。通过RT-PCR和Western Blot显示P21可以被配体结合的RARα所激活从而引起细胞凋亡。结论:通过对ATRA在体外诱导人骨肉瘤细胞和正常造血干细胞分化过程中CAK-RARα通路作用的系统研究,我们得出以下结论:1) ATRA 5μM可诱导骨肉瘤细胞分化,在这一过程中CAK和p21的蛋白水平下降,使细胞阻滞在G1/G0期,并使之最终走向分化。2) ATRA 1μM可诱导正常造血干细胞粒性分化,在这一过程中CDK7和RARα的表达增加,MAT1和P21的表达下降,同时pRb,CDK7及RARα的磷酸化水平都发生下调。3)基因芯片研究结果提示ATRA诱导骨肉瘤细胞分化可能与RARα、RARβ、BMP、WNT和FGF通路有关。4) RARαS77A可以在一定程度上产生与ATRA相似的作用,能显著抑制人骨肉瘤细胞和人CD34+细胞增殖,并能增加ATRA诱导分化的能力。5)筛选出的FGF8,BMP8A及WNT8B可作进一步研究,为细胞分化的机制研究以及新的肿瘤分化诱导剂研究提供实验依据。6) RARαS77A有助于诱导造血干细胞体外粒性分化。这一研究将为临床上体外扩增造血干细胞,诱导其粒性分化,进而治疗白血病提供实验依据。