背景急性肝损伤（Acute Liver Injury,ALI）是由药物、毒物或病毒等物质引起的肝细胞变性、坏死,病情进展较快,可迅速发展为急性肝衰竭,内科综合治疗临床病死率高达70%。由各种病因导致的ALI,肝脏损伤程度远远大于病因本身造成的损伤。研究表明,ALI时肝细胞坏死激活了肝脏免疫系统,进一步加重了肝脏的损伤。间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）具有免疫调节和促进肝损伤修复的作用。MSCs移植治疗ALI的疗效,已经在多种动物模型和临床试验中得到证实,有望成为新的替代治疗手段。研究表明MSCs主要通过调节多种免疫细胞的活化和功能发挥促进肝损伤修复的作用。但是,由于传统流式细胞术存在检测通道受限和荧光素发射光谱重叠的技术瓶颈,现在对于MSCs移植治疗ALI的免疫调节作用的研究主要局限在单个或几个免疫细胞亚群上。但是,免疫系统是由多种细胞和分子组成的动态网络,研究MSCs移植治疗ALI对整个肝脏免疫系统的调节作用是非常必要的。质谱流式技术由Tanner和他的同事在2009首次提出,突破了传统流式细胞术的技术瓶颈,采用金属同位素替代荧光素作为探针偶联抗体,再采用电感耦合等离子体质谱（Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry,ICP-MS）替代激光器和光电倍增管作为检测系统,通过ICP-MS检测偶联抗体的金属同位素信号,可以实现在单细胞水平上同时对40种以上参数进行检测。因此我们采用质谱流式技术,从以下四个方面进行研究,以揭示MSCs移植治疗对ALI小鼠肝脏全免疫细胞的免疫调节作用。首先,我们选出包含小鼠肝脏免疫细胞特异性谱系标志物分子以及功能分子的抗体（合计43个）与金属同位素偶联,设计质谱流式抗体通道并验证质谱流式数据的准确性,选择合适的高维数据分析方法对质谱流式数据进行分析和可视化展示;在此基础上,我们采用这43个抗体对小鼠肝脏固有免疫细胞和适应性免疫细胞进行精准分型,绘制正常小鼠（稳态）肝脏免疫细胞图谱;建立ALI小鼠模型,绘制ALI小鼠肝脏免疫细胞图谱,揭示ALI病程相关的特异性免疫细胞亚群;制备小鼠致密骨来源的MSCs,尾静脉移植ALI小鼠,在验证有效性基础上,研究MSCs移植治疗ALI小鼠肝脏免疫细胞的表型、组成和动态变化,结合前三项研究数据,从肝脏全免疫细胞角度,精准揭示MSCs移植治疗ALI的免疫调节机制,为今后MSCs移植治疗ALI临床转化提供实验依据。方法将包含小鼠肝脏免疫细胞亚群特异性谱系标志物分子和功能分子的抗体（共43个）,与质谱流式仪可检测的金属同位素一一匹配,设计质谱流式抗体通道,再采用多聚螯合物偶联抗体与金属同位素。将制备完成的质谱流式抗体进行浓度滴度检测,并采用多色流式细胞术验证质谱流式数据的准确性;将质谱流式数据手动分析与t-SNE（t-Distribution Stochastic Neighbor Embedding）降维算法结合X-shift聚类算法的分析结果进行比较,验证高维数据分析（t-SNE降维算法结合X-shift算法的分析）的可行性。分离小鼠肝脏全免疫细胞,并对免疫细胞的纯度和活力进行验证。将正常小鼠肝脏全免疫细胞与质谱流式抗体孵育,进行质谱流式检测,得到的数据进行t-SNE降维和X-shift聚类分析,绘制正常小鼠肝脏免疫细胞图谱。采用四氯化碳（Carbon Tetrachloride,CCl₄）腹腔注射诱导小鼠ALI模型。通过对不同时间点ALI小鼠肝脏全免疫细胞进行质谱流式检测和分析,绘制ALI小鼠肝脏免疫细胞图谱。分离、培养和鉴定小鼠致密骨来源MSCs,鉴定包括成脂、成骨的分化诱导和检测表面标志物的表达;通过尾静脉注射MSCs或者PBS,将ALI小鼠分为MSCs治疗组和CCl₄造模组。采集各组小鼠肝脏组织、血清进行病理和生化指标的检测,并记录小鼠的生存率,评估MSCs的治疗效果。将不同时间点MSCs治疗组和CCl₄造模组小鼠的肝脏全免疫细胞进行质谱流式检测和分析,发现MSCs移植治疗ALI发挥免疫调节作用的靶向免疫细胞亚群。结果采用43种质谱流式抗体通道检测,成功建立了可对小鼠肝脏全免疫细胞进行精准分型分析方法;与流式细胞术检测结果相比较,质谱流式检测结果准确;与质谱流式数据手动分析相比较,高维数据分析方法是可行的。分离到的小鼠肝脏CD45⁺免疫细胞纯度>96%,活率>98%。正常小鼠肝脏免疫细胞进行质谱流式检测后,将得到的质谱流式数据进行t-SNE降维和X-shift聚类分析,我们得到25个肝脏免疫细胞聚类,其中主要的免疫细胞有:γδT细胞、Ly6C^hiCD103^lowCD8⁺T细胞、Ly6C^lowCD103^hiCD8⁺T细胞初始CD4⁺T细胞、活化CD4⁺T细胞、Ig M⁺Ig D⁺B细胞、Ig M⁺Ig D^-B细胞、传统自然杀伤细胞（Conventional Nature Killer,c NK）、肝脏常驻NK细胞、单核细胞、单核源性巨噬细胞、浆细胞样树突细胞（plasmacytoid Dendritic Cell,p DC）、CD103⁺DC、CD11b⁺DC、CD11b⁺CD11c⁺MHCII^-DC、单核源性DC、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞;并分析了这些细胞亚群在肝脏免疫系统内的组成和表型。对ALI小鼠肝脏全免疫细胞进行质谱流式检测和分析,结果表明ALI会引起大量肝脏免疫细胞亚群增殖、活化,并招募炎性免疫细胞尤其是髓系细胞浸润损伤肝脏,其中以单核源性DC和单核源性巨噬细胞浸润为主。随着肝损伤的修复,肝脏内免疫细胞的数目逐渐减少,向着稳态时期肝脏免疫细胞数目恢复,但是免疫细胞亚群的表型与肝脏稳态时期存在较大差别。对不同时间点MSCs治疗组和未治疗组小鼠肝脏全免疫细胞进行质谱流式检测和分析,MSCs移植对ALI小鼠肝脏免疫细胞的组成和表型有非常显著调控作用。在急性损伤期,MSCs通过减少Ly6C^lowCD103^hiCD8⁺T细胞、c NK细胞、Ig M⁺Ig D^-B细胞和Ig M⁺Ig D⁺B细胞的数目,下调Ig M⁺Ig D⁺B细胞MHCII的表达和Ly6C^hiCD103^lowCD8⁺T细胞Ly6C的表达,增加免疫抑制性单核来源巨噬细胞的数目,抑制免疫应答,促进肝损伤修复。在恢复期,MSCs通过促进Ly6C^lowCD103^hiCD8⁺T细胞在肝脏组织内滞留,维持单核源性巨噬细胞的免疫抑制活性来促进肝脏免疫系统向稳态恢复。结论我们成功的建立了可以对小鼠肝脏全免疫细胞进行精准分型的质谱流式抗体通道、完成了质谱流式抗体的制备并检测出最佳使用剂量;绘制了正常小鼠和ALI小鼠肝脏免疫细胞图谱,从而揭示ALI病程特异性免疫细胞亚群。在此基础上,通过对MSCs移植治疗ALI小鼠肝脏全免疫细胞的分析,系统揭示了MSCs移植治疗ALI过程中发挥免疫调节作用的靶向细胞亚群,为促进MSCs移植治疗ALI的临床转化应用提供了理论和技术支持