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目的近年来,环境污染引发的雾霾天气在我国频繁出现,对人们的生活、健康都有严重的影响,其中高浓度的PM2.5是导致雾霾天气形成的主要原因。PM2.5粒径小,成分复杂,随呼吸入肺,不溶性成分主要沉积在支气管和肺泡,诱发肺部炎症,造成肺炎、哮喘等一系列肺部疾病,对肺部造成的危害不容忽视。因此找到有效预防及治疗PM2.5诱发肺损伤的药物就显得尤为重要。爵床科植物穿心莲具有清热解毒、凉血之功效,被广泛用于预防和治疗急性呼吸道感染、急性菌痢等疾病。本课题组前期研究发现,穿心莲二萜内酯有效部位AEP、穿心莲内酯A均具有较强的抗炎作用,可减轻大鼠哮喘模型中支气管及肺组织中炎症浸润程度,降低炎症因子的释放,提高免疫因子的水平。而穿心莲内酯的衍生物穿琥宁PDS作为临床用药,治疗肺炎、上呼吸道感染效果显著。因此本课题以气管滴注PM2.5的方式建立大鼠肺损伤模型,并以A及PDS为对照,研究AEP对PM2.5所致大鼠肺损伤的保护作用,并以人支气管上皮BEAS-2B细胞为模型,探讨AEP对PM2.5诱导的BEAS-2B细胞损伤的保护机制,阐述AEP对PM2.5诱导的肺损伤的防治作用及机制,为防治PM2.5诱发及加重呼吸系统疾病提供新思路。方法与结果1.AEP对PM2.5诱导的大鼠肺损伤的保护作用将56只雄性wistar大鼠随机分为7组,每组8只。分别为对照组,PM2.5模型组,A组(200 mg/kg),AEP低、中、高(100、200、400 mg/kg)组,PDS组(200 mg/kg),除PDS组腹腔注射给药,其余各组均灌胃给药,1次/天,周期为28天。在第24天,对照组气管滴注0.9%生理盐水,PM2.5模型组及各给药组气管滴注PM2.5混悬液(8mg/kg),隔日1次共3次。末次染毒24 h后,处死大鼠,收集肺泡灌洗液(BALF),检测BALF中碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、总蛋白(TP)含量,HE染色观察肺病理变化。结果显示:与对照组相比,PM2.5模型组大鼠BALF中AKP、ACP、TP含量均极显著升高(P<0.01);与模型组比较,给药组大鼠BALF中相关酶含量均降低。HE染色结果显示,PM2.5模型组大鼠肺泡间质显著增厚,间质水肿严重,且有大量炎性细胞浸润;AEP给药组的大鼠肺损伤程度降低,炎性浸润情况有明显改善。表明AEP可以降低PM2.5诱导的相关酶的含量,对大鼠肺损伤有保护作用,且AEP调节酶活性的能力强于A和PDS2.AEP对PM2.5诱导BEAS-2B细胞损伤的保护机制采用MTT法检测不同浓度PM2.5悬液(0、100、200、400、600、800μg/m L)、AEP(1、2、4、8μg/m L)、A(1、2、3、4、5μg/m L)、PDS(10、20、30、40μg/m L)对BEAS-2B细胞增殖能力的影响,选定PM2.5染毒条件为400μg/m L 48 h,A的给药浓度在5μg/m L范围内、AEP的给药浓度在8μg/m L范围内。然后实验分为对照组,PM2.5组(400μg/m L),PM2.5+A(2μg/m L)组,PM2.5+AEP低、中、高(1、2、4μg/m L)剂量组和PM2.5+PDS(2μg/m L)组,加药组先用药物预处理1h,再加入400μg/m L的PM2.5,共同培养48h,MTT法检测各实验组中BEAS-2B细胞的活力。结果显示:与对照组相比,PM2.5组极显著抑制BEAS-2B细胞活力(P<0.01);与PM2.5组相比,各给药组可显著增加细胞活力(P<0.05)。ELISA试剂盒检测各组细胞培养液中TNF-α、IL-6的含量,比色法测定各组细胞培养液中LDH活力,化学荧光法检测细胞内ROS强度、比色法检测细胞内SOD活力。结果显示:与对照组相比,PM2.5组细胞培养液中LDH活力,TNF-α、IL-6的含量均极显著升高(P<0.01);而与PM2.5组比较,各给药组细胞培养液中各指标均显著降低(P<0.05),且AEP给药组呈现剂量依赖性。同对照组比较,PM2.5组细胞ROS强度极显著增加,SOD活力极显著下降(P<0.01);与PM2.5组相比,各给药组细胞中SOD含量显著升高(P<0.05),AEP高剂量给药组细胞中ROS荧光强度显著降低(P<0.05)。表明AEP可以通过抑制炎症因子的释放,增强抗氧化酶活性对PM2.5诱导的细胞损伤起保护作用。Western blot检测各组NF-κB及Nrf2/HO-1信号通路中关键蛋白IκBα、p-IκBα、HO-1表达和p65、Nrf2转移入核的情况。荧光定量PCR实验检测各实验组对NF-κB、IL-6、Nrf2、HO-1 m RNA表达水平的影响。结果显示:同对照组比较,PM2.5组细胞的p-IκBɑ、HO-1蛋白表达极显著上调(P<0.01),胞核p65表达量极显著增加(P<0.01),胞核Nrf2表达量增加;与PM2.5组相比,各给药组能上调细胞中IκBɑ、胞质p65蛋白表达,下调p-IκBɑ、胞核p65蛋白表达,上调HO-1、胞核Nrf2表达蛋白表达。荧光定量PCR实验结果显示:各实验组NF-κB、IL-6、Nrf2、HO-1 m RNA的c DNA均有效扩增,且扩增产物专一性良好。同对照组比较,PM2.5组细胞的NF-κB、IL-6 m RNA表达极显著升高(P<0.01),Nrf2、HO-1 m RNA表达显著升高(P<0.05);与PM2.5组相比,各给药组均能显著降低NF-κB、IL-6 m RNA表达(P<0.05),其中AEP给药组能显著上调Nrf2、HO-1 m RNA表达(P<0.05)。结论AEP对PM2.5所诱导的大鼠肺损伤有保护作用,可显著降低ACP、AKP的含量,减少TP的渗出,缓解肺泡间质增厚及炎性细胞浸润,减轻炎症反应,从而起到肺保护作用。AEP可显著减轻PM2.5诱导的BEAS-2B细胞损伤,降低LDH活力及TNF-α、IL-6的含量,下调p-IκBɑ蛋白表达,抑制p65向细胞核中的转移及其转录水平,进而抑制NF-κB通路的激活,抑制炎症因子IL-6的转录水平,减轻炎症反应,同时增加Nrf2在转录水平和蛋白水平的表达,激活Nrf2/HO-1通路,上调其下游蛋白HO-1在转录水平和蛋白水平的表达,增强抗氧化能力,对PM2.5诱导的细胞损伤起保护作用。