【摘 要】
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研究背景及目的:脑卒中（stroke）是一类高发病率、高致死率和高致残率的脑疾病。本文第一部分重点关注了一种新的生长因子骨髓源性生长因子（Myeloid-derived growth factor,MYDGF）在脑缺血再灌注后神经保护及促血管新生的作用。课题组前期研究发现:传统观点认为只能和GPCR（G蛋白偶联受体）结合的G蛋白抑制性α亚单位1和3（Gαi1/3）,在多个生长因子刺激下,也能和其受
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研究背景及目的:脑卒中（stroke）是一类高发病率、高致死率和高致残率的脑疾病。本文第一部分重点关注了一种新的生长因子骨髓源性生长因子（Myeloid-derived growth factor,MYDGF）在脑缺血再灌注后神经保护及促血管新生的作用。课题组前期研究发现:传统观点认为只能和GPCR（G蛋白偶联受体）结合的G蛋白抑制性α亚单位1和3（Gαi1/3）,在多个生长因子刺激下,也能和其受体结合,介导下游通路的活化。本课题第二部分将重点解析Gαi1/3在MYDGF信号转导及促血管生成中的作用。研究方法:大脑中动脉闭塞（MCAO）法建立小鼠脑缺血再灌注损伤模型,利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹实验（Western blotting）检测缺血后MYDGF表达水平;对原代小鼠小胶质细胞、星型胶质细胞和皮层神经元进行体外糖氧剥夺再灌注（OGD/R）实验,检测这三种细胞中MYDGF的表达水平;对SH-SY5Y细胞和小鼠原代皮层神经元进行体外OGD/R实验,观察添加MYDGF后的神经细胞的保护作用;小鼠脑立体定位注射带有小胶质特异性启动子的MYDGF shRNA腺病毒,条件性敲减小胶质细胞中MYDGF表达;之后建立MCAO模型,进行脑缺血后小鼠神经功能行为学评分,通过TTC（2,3,5—氯化三苯基四氮唑）染色及CD31染色等研究MYDGF敲减对脑缺血再灌注后的缺血灶损伤面积及血管生成的影响;利用野生型小鼠和Gαi1/3-DKO（双敲除）小鼠建立MCAO模型,TTC染色检测脑缺血再灌注后Gαi1/3对缺血灶损伤面积的影响,通过CD31免疫荧光检测血管生成情况;在小鼠成纤维母细胞（MEFs）中通过多种基因手段,包括显性负性遗传、CRISPR/Cas9敲除、腺病毒表达载体等改变Gαi1/3表达及活化,后添加MYDGF处理,检测PI3K-Akt-mTOR以及Erk-MAPK通路的活化水平;转染慢病毒包裹的Gαi1/3 shRNA敲减人脑微血管内皮细胞（HCMEC）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中Gαi1/3,检测MYDGF下游PI3K-Akt-mTOR以及Erk-MAPK通路活化水平,利用成管实验（tube formation）、细胞迁移实验（Transwell）和2’-脱氧-5-乙炔尿苷（EdU）方法检测内皮细胞成管、迁移和增殖。研究结果:MCAO模型脑缺血侧MYDGF的mRNA和蛋白表达升高;MYDGF主要由小胶质细胞分泌;添加MYDGF拮抗OGD/R诱导的神经元损伤;小鼠脑立体定位注射带有小胶质特异性启动子的MYDGF shRNA腺病毒,条件性敲减小胶质细胞中MYDGF表达,脑缺血后神经功能行为学评分检测发现MYDGF敲减后导致神经损伤严重,同时急性期（24小时）缺血灶损伤面积增大、恢复期（7-14天）新生血管数量减少;运用野生型小鼠和Gαi1/3-DKO（双敲除）小鼠建立MCAO模型,TTC染色发现Gαi1/3 DKO后缺血灶损伤面积显著增大,且恢复期缺血灶血管数量减少;MEFs中显性负性遗传抑制Gαi1/3的活化后,抑制MYDGF诱导的PI3K-Akt-mTOR和Erk-MAPK信号通路活化;CRISPR/Cas9敲除Gαi1/3后几乎阻断MYDGF诱导的PI3K-Akt-mTOR以及Erk-MAPK通路活化;而过表达Gαi1/3后强化MYDGF下游信号活化;在体外培养的血管内皮细胞中,添加MYDGF激活PI3K-Akt-mTOR和Erk-MAPK通路,并诱导内皮细胞体外成管,迁移和增殖;添加慢病毒包裹的Gαi1/3 shRNA下调Gαi1/3的表达,导致MYDGF诱导的PI3K-Akt-mTOR和Erk-MAPK信号通路被抑制,并显著抑制MYDGF诱导的内皮细胞成管,迁移和增殖。研究结论:脑缺血再灌注后,小胶质来源的MYDGF表达增加促神经保护（急性期作用）和血管新生（恢复期作用）;Gαi1/3是MYDGF诱导的下游信号的关键分子。
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