论文部分内容阅读
目的通过研究对人类具有致病性的肺炎克雷伯菌噬菌体和对人-畜-鱼类具有致病性的嗜水气单胞菌噬菌体的生物学特性和基因组学的特点,为噬菌体疗法在今后的应用以及噬菌体基因组学的深入研究提供理论依据和数据支持。方法以肺炎克雷伯菌(530株)为指示菌从北京307医院的污水中分离出噬菌体vB_KpnS_IME279,同时以嗜水气单胞菌(A18株)为指示菌,从南京众彩物流水产市场的污水中分离出噬菌体A18P4。通过观察两株噬菌体在双层平板上裂解指示菌后产生的噬菌斑、透射电镜下两株噬菌体的形态、及测定噬菌体的最佳感染复数、一步生长曲线、噬菌体对温度与pH的敏感性和噬菌体的裂解谱分析这两株噬菌体的生物学特性;通过二代高通量测序技术对两株噬菌体进行基因组测序,将测序所得噬菌体的全基因组序列进行基因组功能注释和构建进化树等方法来分析两株噬菌体的基因组特征;采用生物信息学方法对噬菌体基因组末端进行分析。结果(1)本研究以从医院病人的尿液中分离出的肺炎克雷伯菌(530株)为指示菌从医院的污水中分离得到了一株肺炎克雷伯菌噬菌体,命名为vB_KpnS_IME279;实验结果显示该噬菌体裂解宿主菌后形成斑体透明、大小均一的噬菌斑;透射电子显微镜图显示噬菌体vB_KpnS_IME279属于短尾噬菌体科(Podoviridae);噬菌体vB_KpnS_IME279的最佳感染复数为0.1,一步生长曲线显示该噬菌体的潜伏期为20min,80min时裂解期的裂解量为138PFU/Cell;该噬菌体对高温和强酸强碱较敏感;该噬菌体的裂解谱较窄,可以裂解的肺炎克雷伯菌的ST和wzi基因型分别有ST11,ST37,ST375、wzi209、wzi52、wzi12和wzi72;通过高通量二代测序技术获得该噬菌体的全基因组序列,该噬菌体的基因组序列是双链线性DNA,基因组全长为42621bp,GC含量为59.3%(GenBank登录号:MF614100.1);经RAST在线注释后得到61个开放阅读框(ORF),其中有41个ORF编码了假想蛋白,剩余20个ORF编码了功能蛋白;经BlastN核酸比对,噬菌体vB_KpnS_IME279与其他在NCBI库中的噬菌体的同源性较低。(2)以嗜水气单胞菌(A18株)为指示菌从南京众彩物流水产市场的污水中分离出一株嗜水气单胞菌噬菌体A18P4,透射电镜图显示该噬菌体为长尾噬菌体科(Siphoviridae);噬菌体A18P4的最佳感染复数为0.1,一步生长曲线显示该噬菌体的潜伏期为1h,8h裂解期的裂解量为202PFU/Cell;该噬菌体在40-60℃的温度条件下存活率较高,pH在4-11范围内时噬菌体较稳定,该噬菌体的裂解谱较宽。通过二代高通量测序所得噬菌体A18P4的基因组全长为60795bp,为DNA双链线型结构,GC含量为62%(GenBank登录号:MN317029.1);BlastN核酸比对结果显示,在NCBI数据库中,仅有一个噬菌体LAh7(GenBank登录号:MK838113.1)与噬菌体A18P4具有同源性,同源性相对较低(基因组同源区占基因组长度的66%,最大同源性(Identity)为80.64%);经RAST在线注释后得到73个ORF,其中有48个ORF被预测为编码了假想蛋白,其他25个ORF编码了功能蛋白。采用本实验室建立的末端分析技术进行分析,结果显示该噬菌体中不存在固定末端,即提示该噬菌体的末端基因是随机的。结论(1)本研究中,肺炎克雷伯菌噬菌体vB_KpnS_IME279属于短尾科噬菌体,该噬菌体的潜伏期短,裂解性较强,裂解谱较窄。该噬菌体的基因组全长为42621bp,含有61个ORF,不含毒素基因。(2)嗜水气单胞菌噬菌体A18P4属于长尾噬菌体科Chivirus属病毒,该噬菌体的潜伏期长,裂解性较强,裂解谱较宽,该噬菌体的基因组全长为60795bp,包含61个ORF。