声音的时间信息和频谱信息对言语识别非常重要。言语信号中的大部分信息都包埋在随时间变化的振幅和频谱中。因此,声音的时间特性是声音的重要信息载体之一。然而,目前关于中枢神经系统对声音时间特性和强度特性处理机制的认识比对频率特性的了解要少得多。本论文中研究内容包括三部分：第一部分,给予小鼠以不同强度和时程的声音刺激,采用在体细胞外技术记录下丘(inferior colliculus, IC)神经元单单位(single unit)反应；第二部分,制备包含IC在内的脑薄片,在形成膜片钳全细胞记录模式后,电流钳下(I-clamp)向IC神经元内注入不同波形、不同方向、不同强度和时程的电流刺激,记录IC神经元的膜电位反应；第三部分实验方法同第二部分,研究对象是听觉中枢的单突触模型-斜方体内核(the medial nucleus of the trapezoid body, MNTB)。这样,通过以上三组实验改变时程和强度这两个刺激参数,分析听觉中枢对刺激信息的反应参量(动作电位发放数和发放时间),以期探讨听觉中枢神经元对于刺激信息编码的可能机制。第一部分以往关于听觉神经元对声刺激时程反应的研究,主要是以神经元动作电位发放数(spike count, SC)或发放率(spike rate)为反应指标,而以神经元发放时间(spike timing)为指标的研究较少,而仅有的一两个研究也只是固定在特定声音强度下进行。时程调谐已在各类蝙蝠听觉中枢进行了大量的研究。近年来,在各种非回声定位动物听觉通路的不同水平均发现了时程调谐(duration tuning)神经元的存在。然而这些研究提示非回声定位动物时程调谐神经元的数量要明显小于回声定位动物,并且其中一些时程调谐神经元的时程调谐类型还会随着刺激类型和强度的不同而发生改变。本论文第一部分实验中,给予小鼠特征频率(characteristic frequency, CF)下不同强度和时程的纯音刺激后,采用在体细胞外技术记录其IC神经元反应,包括神经元的时间放电模式,以动作电位发放概率(probability, P)、发放数(spike counts per stimulus, SC)和发放时间(first spike latency, FSL)作为观察指标分析IC神经元对声刺激时程和强度的反应。本部分实验共记录到50个IC神经元,它们的CF在7～42 kHz,阈值在10-80dB SPL。绝大多数(84%)IC神经元对纯音刺激呈现出给声响应(onset)型放电模式；以SC为观察指标时,有42%IC神经元表现出不同程度的时程选择性,以长通型(long-pass)时程调谐所占为多(占IC神经元总数36%),且long-pass调谐中以onset反应神经元为主,高达56%。由此可知,在小鼠IC时程调谐神经元的数量与回声定位动物相当,时程调谐可以在除撤声响应(offset)神经元以外的其他神经元中表现出来。尽管,其中一些时程调谐神经元存在着强度依赖性,既往一些研究认为这些神经元并非真正的时程调谐神经元,但我们认为这些强度依赖性时程调谐神经元,在增加了强度变量后,其对于声音时程的编码能力更强,可编码更加复杂多变的刺激时程,从而得以应对外界复杂多样的刺激信息。另一方面,当FSL作为观察指标时,这些时程调谐神经元的反应时间不会随着刺激时程而改变)。因此,对这些时程调谐神经元来说,刺激信号的时程信息不是由神经元的动作电位发放时间而是由动作电位发放数或者发放概率来表达。在该部分实验中还研究了在不同刺激时程下神经元对声音强度的反应,发现以动作电位发放数作为观察指标,强度反应关系表现出多样性(单调型monotonic、非单调型non-monotonic、饱和型saturated)和不稳定性(60%IC神经元的强度反应类型会随着刺激时程变化而发生改变)。而以动作电位发放时间为观测指标,规律比较单一且稳定,即FSL随着声音强度增大而逐渐缩小,并且不存在时程依赖性。因此,对听觉中枢神经元来说,刺激信号的强度信息由神经元的反应时间来表征更为准确、稳定,并表现出高度的一致性。第二部分兴奋性输入和抑制性输入的相互作用,是听觉神经元进行信息整合的重要细胞机制之一。长期以来,接受兴奋性去极化刺激后能够产生动作电位一直是判断细胞具有兴奋性的唯一标准,然而大量的实验发现,神经元在接受超极化刺激后也能爆发动作电位。这种抑制后出现的兴奋性去极化反跳(rebound depolarization, RD)现象作为神经元的基本膜特性,已在许多不同脑区(例如小脑、海马、丘脑等)记录到,提示RD现象对于神经元的放电模式、节律活动和突触可塑性具有重要调节意义。已经有许多研究提示,在听觉信息传递及处理过程中,抑制性信息起到了关键性的作用。对于蝙蝠时程调谐的研究已很好地阐述了抑制性输入在时程调谐中的作用,然而到目前为止,尚没有在非回声定位动物身上验证抑制性输入在时程调谐中作用的报道。本论文第二部分研究中,采用离体脑片全细胞膜片钳技术,I-clamp模式下向IC细胞中注入兴奋性去极化电流和抑制性超极化电流,观察IC神经元对兴奋性和抑制性输入作用的细胞膜电生理学基础。考虑到听觉系统接收的外界信息常常是动态变化的,所以在本研究中,我们将给予细胞注入step波和ramp波电流,观察神经元对不同波形变化的电流强度及时程的反应。其中,step波形是一种稳态变化的电流或电压。而ramp则是一种逐渐变化的电压或电流,称为“斜坡电压或电流”。本部分实验中共记录到20个IC神经元全细胞反应。当IC神经元接受兴奋性输入时,细胞膜去极化引发动作电位(action potential, AP),其FSL随着电流强度增大而逐渐缩短,而与去极化电流时程无相关性。而当IC神经元接受抑制性输入时,约35%IC细胞可出现RD现象并在达到阈值后引发AP产生。并且IC神经元在被抑制后出现RD所引发的FSL,不仅与超级化电流强度相关,还与超级化电流时程相关,即随着超极化电流强度的增大或时程的延长,均表现出逐渐缩短的趋势。第三部分中枢神经系统的突触联系非常复杂,绝大多数神经元接受多个突触传入,当进行局部环路神经联络的研究时,记录到的神经元反应与电刺激的关系,并非是一对一的输出与输入关系(the relation of the output and input, O/I)。另外,神经突触非常小一直是限制全细胞膜片钳记录技术得以推广应用的重要因素之一。幸运的是,在听觉传导通路中,存在这样特殊的一种突触-海德氏突触(thecalyx of Held),它位于脑干斜方体内侧核(the medial nucleus of the trapezoid body, MNTB)。最初,Held突触由于个头大(细胞直径通常为8～20μm)而被人们发现。有解剖学证据显示,Held突触源自耳蜗前腹核球形丛细胞(globular bushy cell)的兴奋性传入,然后投射到MNTB主细胞,这样MNTB形成听觉系统第三级突触。且通常认为一个MNTB主细胞仅接受一个突触前细胞-杯状盏(calyx)的传入,即MNTB还具有典型的单突触传递特性。这样,细胞个头大,再加上其具有单突触传递特性,MNTB已被认为是突触研究的理想模型之一。本论文中第三部分,采用离体脑片全细胞记录技术对MNTB主细胞进行膜基本电生理学性质的研究。实验中共记录到40个MNTB主细胞,在注入正向去极化电流时均可引发AP。其中约32%的MNTB主细胞在注入超极化电流刺激后可出现RD并引发AP。本实验中分析了三种波形变化(稳态变化的step、动态变化的rise-ramp和fall-ramp)电流对于FSL-电流强度或FSL-电流时程关系的影响,并借此分析了MNTB主细胞对去极化电流及超极化电流的时间反应特性。结果发现,在向MNTB主细胞内注入兴奋性去极化电流时,其FSL主要取决于刺激电流起始部分的电流强度,强度越大,FSL越小,而与电流时程无关；SC则与电流后续部分的强度及时程均相关,强度越大或时程越长,SC越多。在向MNTB主细胞内注入抑制性超极化电流时,影响抑制后RD产生的可能因素至少包括以下三点：一,超极化电流结束瞬间的电流强度。超极化电流结束瞬间的电流变强度越小,越有利于细胞恢复到RMP,细胞膜兴奋性越高；二,超极化过程中的电流强度。超极化过程中电流强度越大,产生RD幅度越大,也越容易引发AP；三,超极化电流的时程。注入超极化电流的时程越长,产生RD幅度越大,也越容易引发AP。总结这样,根据以上三部分实验结果,我们可以大致推断出听觉中枢对外界刺激信息的编码方式如下：对于兴奋性输入信息,听觉中枢神经元可通过动作电位发放时间(FSL)、动作电位发放数(SC)来编码。其中,FSL编码了刺激起始部分的强度大小,刺激起始部分的强度越大,FSL越短,代表动物或人能在越短的时间内辨识该声音信息。而SC则在一定程度上可以编码刺激后续部分的强度和时程,刺激后续部分的强度越大,时程越长,SC就越多。这样,我们可以把兴奋性信息的输入过程简单分为两个时间窗口：起始部分(the onset of duration)和后续部分(thesubsequence of duration)。这两个时间窗口内的刺激参量所起的作用不同：onset部分主要与FSL密切相关,而subsequence部分则与SC密切相关。对于抑制性输入信息,听觉中枢神经元除了直接削弱或抵消同时到达的兴奋性信息外,还可以通过抑制后的兴奋性去极化反跳(RD)来实现对细胞膜兴奋性的调节作用。这样,抑制性信息出现的时机,对于神经元的输出起到了关键性的调节作用：若抑制性信息出现在兴奋性输入的起始窗口,可同时对神经元的FSL和SC进行调制；如出现在后续窗口,则可对SC进行调制。从而使得听觉中枢神经元能够表现出多种放电模式。