致病疫霉线粒体单倍型PCR检测方法的建立及应用

来源 :河北农业大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:eric73384
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本研究在对4个致病疫霉线粒体单倍型(Ia,Ib,IIa和IIb)基因组序列多态性系统分析和对已有的3种线粒体单倍型检测方法系统分析的基础上,提出并建立了以PCR为基础的致病疫霉线粒体单倍型快速检测的新方法。本研究通过分析致病疫霉线粒体多态性,发现了致病疫霉线粒体基因组中由大片段插入/缺失引起的2个高变区即HVRi和HVRii,并将其确定为线粒体单倍型检测方法的目标区域。第一个高变区HVRi由长度为1885bp的片段插入/缺失引起,该高变区用于直接确定1990年Carter等人限制性内切酶酶切发现的用于区分由线粒体基因组长度引起的不同线粒体类型,即type I和type II。而第二个高变区HVRii不同数目(n=1,2,3)由36bp重复单元构成。该区域扩增子长度多态性应用于线粒体新类型的确定。综合致病疫霉线粒体两个高变区,将其单倍型划分为6种类型即I R1,I R2,I R3,II R1,II R2和II R3。本研究以23株致病疫霉菌株为例,用PCR方法检测出5种线粒体单倍型,未发现II R1型。同时,在被测的23株代表性菌株中也发现了6个type I型菌株的错误鉴定,它们是由于PCR-RFLP方法中P4产物第二个酶切位点识别序列中的碱基C突变为T而造成的。利用新建的PCR方法测定我国10个省、市、自治区共459株致病疫霉菌株的线粒体单倍型。其中,引起马铃薯晚疫病菌共计434株,共发现了5种线粒体单倍型,仍未发现II R1;引起番茄晚疫病的共25株并且其中仅发现1种单倍型即I R3。本研究基于PCR技术建立的病疫霉线粒体单倍型检测方法,简单、快速、准确,可广泛用于致病疫霉群体结构、动态变化和演化研究。此外,分析序列发现II型通过不同方式的大片段缺失而形成I型,我们推断II型线粒体比较古老。
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