研究背景：生殖道菌群在女性一生的不同年龄段各具特征,其结构组成与体内雌激素、孕激素水平紧密相关。健康育龄期女性生殖道微生物群落结构通常可以划分为五种：CST Ⅰ, CSTⅡ, CST Ⅲ, CST Ⅳ和CST Ⅴ。而CST Ⅳ则是以多样性菌属为主,又可分为两种亚类：CST Ⅳ-A和CST Ⅳ-B。妊娠期是育龄女性特殊的生理时期。妊娠期母体内雌激素、孕激素发生了剧烈变化,雌激素最高峰期水平比非孕期上升了1000倍。受高浓度雌激素水平的影响,阴道上端1/3的表皮细胞生长、细胞内糖原增多,乳酸的产量亦随之增高,维持阴道较低的pH值,妊娠期生殖道菌群与阴道内皮细胞、阴道分泌物形成一道天然屏障,共同促进母婴健康。妊娠期除了激素水平的剧增,还包括众多干扰因素对阴道菌群的影响,如：母体免疫状态的改变、母体的体重增加、全身各大系统适应性变化、胎儿发育、营养需求增加、药物使用等。我们想了解在妊娠的不同时期,随着孕周增长,生殖道菌群是否也随之发生适应性变化,孕期母体自身因素、环境改变、机能状态的改变等是否会影响生殖道菌群的结构。分娩过程中羊水、血液等对阴道进行了彻底的冲刷,同时体内激素水平迅速下降,生殖道微生物必须适应机体的变化,面临重建微生态环境的过程。产后全身各系统(除乳房外),尤其是生殖系统,因妊娠所引起的变化将逐步恢复到孕前状态,产后生殖道群落结构是否也恢复到孕期状态,需要进一步研究。妊娠期生殖道菌群失调在临床上最常见表现为细菌性阴道炎(Bacterial Vaginosis, BV)。BV的生殖道菌群是以乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)丰富度降低,继而由兼性厌氧菌或者绝对厌氧菌代替,菌群多样性显著增加。与BV密切相关的菌属包括：Gardnerella(加德纳菌属),Anaerococcus (气球菌属),Corynebacterium(棒状杆菌属), Finegoldia(达芬戈尔德菌),Streptococcus(链球菌),Atopobium(奇异菌属), Prevotella(普氏菌属),Parvimonas(微单胞菌属),Sneathia(纤毛菌属),Mobiluncus(动弯杆菌属),Peptoniphilus(吲哚嗜胨菌),BVAB1,BVAB2,BVAB3。BV可导致众多妊娠不良结局如：胎膜早破(Premature rupture of membranes, PROM)、早产(Preterm birth, PTB)、低出生体重儿(Low birth weight)、绒毛膜炎(Chorioamnionitis)等,对孕妇和新生儿健康均产生了不利影响。与阴道细菌感染密切相关,且又能影响围产期母婴健康的主要不良妊娠事件有胎膜早破和早产,是新生儿病死率最主要和最常见的原因。近年来研究认为,孕期感染与胎膜早破和早产密切相关。胎膜早破指临产前胎膜破裂,与羊膜腔感染、早产组成的与感染密切相关的综合症候群,是妊娠晚期的严重并发症。传统方法采用穿刺手段诊断胎膜早破,但是具有创伤性。目前,研究者致力于炎症细胞因子与胎膜早破的关联,误诊率和漏诊率较高。截止目前,临床尚缺乏无创性诊断胎膜早破的金标准,快速、方便、准确诊断胎膜早破仍然是研究者面临的挑战。不良妊娠结局与母体个体差异、免疫状态、营养、药物、环境因素有关。由于研究者侧重点差异,种族文化差异、是否纳入了重要的影响因素,生殖道菌群与围产期母婴健康的关联研究在该领域似乎没有得到一致的结果。生殖道菌群与不良妊娠结局的关联,还需要更多的数据阐释。研究目的：1.孕妇的生殖道不同采样部位(宫颈、后穹窿、阴道下1/3)的菌群是否具有差异；2.观察女性孕期生殖道菌群的特征及动态变化过程；3.了解产后42天生殖道菌群恢复情况；4.运用孕期生殖道菌属信息结合元数据(临床信息)预测不良妊娠结局。研究方法：第一章2012年12月～2013年01月,在南方医院妇产科门诊进行常规检查,签署知情同意书的情况下,纳入志愿者共34人,分别是：非孕妇5人,孕早期6人(孕周<14周),孕中期6人(孕14～28.6周),孕晚期12人(孕29～42周),产后5人,编号为S1～S34。由经验丰富的妇产科医生,使用窥阴器撑开阴道,在肉眼直视下,使用一次性使用棉签拭子,分别采集宫颈(Cervix, C)、后穹窿(Posterior fornix, P)、阴道下1/3 (Vaginal canal, V)三个部位的分泌物,每个部位采集三个平行样品,共计306个样品。采集的样品暂时存放于生物样品运输箱,在4小时内转移至-80度低温冰箱保存,直到提取样品中细菌的总DNA。使用细菌16S通用引物,PCR扩增阴道拭子样品的16S rRNA V46保守区。将PCR终产物经过Illumina Hiseq 2000平台进行PE100-bp测序后,得到高通量下机原始碱基序列,采用QIIME分析流程结合临床信息分析数据。QIIME生物分析主要包括操作分类单元(Operational Taxonomy Units, OTU)的生成及主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)、假设验证分析、进化树分析及菌群特征性分析、菌属丰富度分析、群落结构多样性分析、菌群间差异比较分析(LEfSe在线统计分析工具)等。采用SPSS 20.0软件进行数据分析,数据结果以均数±标准差(Mean±S)表示;两组之间均数比较采用两样本t检验,三组及以上均数比较采用One-way ANOVA,多个处理组两两比较用Bonfferonii比较,矫正检验水准。P<0.05具有统计学显著性差异。第二章2013年01月～12月,在南方医院妇产科门诊首次进行常规产科检查,同意参与队列研究,签署知情同意书,经过HCG、B超诊断等确诊为宫内妊娠的对象,根据末次月经推算孕周,若孕周大小与主诉相差甚大,则以孕早期B超结果计算孕周。由经验丰富的妇产科医生,使用窥阴器动作轻柔撑开阴道,在肉眼直视下,使用一次性棉签拭子,采集后穹窿的分泌物,同时评估阴道分泌物的性状、颜色、气味、宫颈糜烂情况。使用一次性pH(3.8～5.5)精密试纸检测阴道分泌物的酸碱度。采集样品的同时,记录每次孕妇的产检信息,包括：入组时采集孕妇基本信息、产检信息、全身各系统疾病、丈夫健康状态、既往孕产史、既往生殖道患病史、用药史、妊娠合并症等。随访时查阅孕妇的阴道分泌物、临床常规检查资料。队列随访完毕,通过档案中心调阅孕妇的分娩结局、分娩方式和新生儿体重等信息。胎膜早破(Premature Rupture of Membranes, PROM)指临产前胎膜破裂,是一组与感染密切相关的综合症候群,诊断标准：(1)突然见阴道内有较多液体流出,可见胎脂及胎粪,肛诊将胎先露部上推见阴道流液量增多；(2)窥器检查见液体自宫颈口流出或阴道后穹隆有较多混有胎脂和胎粪的液体；(3)阴道分泌物酸碱试纸测定阴道液可用试纸法测定pH>6.5。早产(Preterm Birth, PTB)是指在妊娠满28周至不满37周分娩者。绒毛膜炎是通过病理组织切片发现绒毛膜上面覆盖炎症细胞而作出的病理检查诊断。新生儿窒息是指出生后1min Apar评分<7分。纳入志愿者共340人,首次产检并建立围产保健卡,动态随访孕期生殖道菌群动态变化。分别采集孕18周(Sample 1, S1)、孕29周(Sample 2, S2)、孕37.6周(Sample 3, S3)、产后6.4周(Postpartum, PP)后穹窿的分泌物。孕期三个时间点采集到样品的人数分别为：340人、298人、205人,产后采集到73人的样品,总共采集样品916个样品。采集的样品暂时存放于生物样品运输箱,在4小时内转移至-80度低温冰箱保存,直到提取样品中细菌的总DNA。使用细菌16S通用引物,PCR扩增阴道拭子样品的16S rRNA V4保守区。将PCR终产物经过Illumina Hiseq 2000平台进行PE100-bp测序后,得到高通量下机原始碱基序列,采用QIIME分析流程结合临床信息分析数据。QIIME生物分析主要包括OTU的生成及PCA、假设验证分析、进化树分析及菌群特征性分析、菌属丰富度分析、群落结构多样性分析、菌群间差异比较分析(LEfSe在线统计分析工具)、运用机器学习随机森林预测模型分析孕期菌属与不良妊娠结局的关联。采用SPSS 20.0软件进行数据分析,数据结果以均数±标准差(Mean±S)表示：两组之间均数比较采用两样本t检验,三组及以上均数比较采用One-way ANOVA,多个处理组两两比较用Bonfferonii比较,矫正检验水准。P<0.05具有统计学显著性差异。研究结果：第一章1.从306个样品中,我们获取了720,601条高质量16S rRNA基因序列,每个样品平均2,354条序列。35个样品由于测序深度<1000条而被滤过剔除,271个样品纳入后续分析。2.阴道菌型(Community State Type, CST)主要分为四型：CST Ⅰ (L. crispatus), CST Ⅱ (L. gasseri), CST Ⅲ (L.iners), CST Ⅳ主要以多样性菌属为特征,乳酸杆菌丰富度降低,阴道菌群主要以Lactobacillus spp.为优势菌。3.宫颈(Cervix)、后穹窿(Posterior fornix)、阴道下1/3(Vaginal canal)三个部位的菌群分布相似,都未能有显著区分,菌群alpha多样性无统计学差异。4.宫颈(Cervix)、后穹窿(Posterior fornix)、阴道下1/3(Vaginal canal)三个部位细菌种属的“属”水平分布相似,6名研究对象的菌属内部构成的有微小差异,但并未影响其整体菌群结构。第二章1.队列入组孕妇340例,总共采集了916个样品。我们获取了15,606,477条高质量16S rRNA基因序列,序列数最低为3070条,最高为71,839条,将测序深度标化到3000条,所有的样品纳入后续分析。每个样品平均17,037条序列。2.孕妇年龄从19.0-40.0岁,平均(28.5±3.7)岁,分娩孕周平均为(39.1±1.2)周,新生儿体重平均为(3297.2±398.7)克,23例孕妇由于失访而未能记录分娩结局,317例孕妇能查询到分娩结局。本研究跟踪到的结局中,胎膜早破发生率为28.7%(66/230)。早产发生率为3.5%(11/317)。绒毛膜炎发生率为4.4%(14/317)。剖宫产的机率为32.8%(106/317)。新生儿窒息发生率为5.0%(16/317)。根据常规阴道分泌物检查,将结果分为：“好”、“临界”、“差”三级。“好”(58.9%)是指：清洁度(Ⅰ/Ⅱ)、霉菌(-)、滴虫(-)、白细胞数量(+/++)、BV(-),占,用药率为0.6%；“临界”(15.1%)是指：清洁度(Ⅱ/Ⅲ)、霉菌(-/+)、滴虫(-/+)、白细胞数量(++/+++)、BV(-/+),用药率为16.0%；“差”(26.0%)是指清洁度(Ⅲ/Ⅳ)、霉菌(-/+)、滴虫(-/+)、白细胞数量(+++/++++)、BV(-/+),用药率为36.3%。3.生殖道菌群主要分为五大型(CSTⅠ-CST Ⅴ),其中有四型属于乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.),占绝对的优势(占85%)。它们分别是：L. crispatus (CST Ⅰ,39.1%), L. gasseri (CST Ⅱ,3.9%), L. iners (CST Ⅲ,36.3%)和L. jensenii (CST Ⅴ,4.5%)。CST Ⅳ又可以分为两大亚类：CST Ⅳ-A (14.7%)和CST Ⅳ-B(1.5%)。各菌型的pH比较发现,以CST Ⅳ-A (4.8%)最高,和其他各组相比,差异具有统计学意义。4.孕期菌型保持相对稳定达78.8%,菌型发生波动占21.2%,但主要还是在乳酸杆菌属之间波动,很少转化为多样性丰富的菌型(CST Ⅳ-A).其中,孕期28例阴道局部使用药物(抗生素、抗真菌药)治疗后,菌型保持稳定达78.6%(20/28),菌型波动比例占21.4%(8/28),与未用药的孕期菌型稳定性相比,差异无统计学意义(χ2检验,P=0.303)。说明孕妇阴道局部使用药物对生殖道群落结构的稳定性影响不大。5.孕期阴道菌群主要以乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)为优势菌维持较低的pH值(4.1),群落结构单一。产后42天主要以CST Ⅳ-A (78.1%)为主要菌型,菌群结构多样性丰富,pH值(5.2)显著高于孕期样品。产后42天阴道菌群大部分都未恢复到以乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)为优势菌的状态。菌属的alpha多样性评估指标,包括：Chao 1, PD whole tree, Observed species, Shannon index结果显示：孕期三个样品(S1, S2, S3)的alpha多样性较低,各组之间差异无统计学意义。但是产后(Postprtum) alpha多样性较孕期显著升高,差异具有统计学意义(秩和检验,P<0.05)。顺产、剖宫产阴道菌型CST Ⅳ-A所占比例分别为73.5%(36/49)和87.5%(21/24),两者比较差异无统计学意义(卡方检验,P=0.173)。说明产后菌型恢复情况与分娩方式(顺产或剖宫产)无关。6.孕期阴道菌型(CST)与不良妊娠结局包括：胎膜早破(Premature rupture of membranes, PROM)、分娩方式(剖宫产发生率)、绒毛膜炎(Chorioamnionitis)、 早产 (Preterm birth, PTB)、新生儿窒息(Asphyxia)尚未发现关联。7.孕妇年龄是影响胎膜早破的最重要的因素,随着孕妇年龄的增长,胎膜早破的发生率逐渐增加。当孕妇年龄<30岁,孕期致病菌的差异对胎膜早破并未造成影响。但是,当孕妇年龄>30岁,Megasphaera(巨球菌属),Gardnerella(加德纳菌),Sneathia(纤毛菌属),Prevotella(普氏菌属)的丰富度增高与胎膜早破呈现正相关,是危险因素；而Lactobacillus spp.(乳酸杆菌属)与胎膜早破呈现负相关,是保护因素。结论：1.宫颈(Cervix)、后穹窿(Posterior fornix)、阴道下1/3 (Vaginal canal)三个部位的细菌群落结构具有高度相似性,任意部位的菌群能够代表生殖道群落结构特征。2.生殖道菌群主要分为五大型(CSTⅠ-Ⅴ),其中有四型属于乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.),它们分别是：L. crispatus (CSTⅠ), L. gasseri (CST Ⅱ), L. iners (CST Ⅲ)和L. jensenii (CST Ⅴ)。CST Ⅳ又可以分为两大亚类：CST Ⅳ-A和CST Ⅳ-B。3.孕期生殖道菌群主要以乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)为优势菌,且菌群结构非常稳定,孕期阴道局部使用药物并不影响整体群落结构。产后6周主要以CST Ⅳ-A为主要菌型,菌群结构多样性丰富。分娩方式并未影响产后菌群的恢复。4.孕期生殖道菌型(CST)与不良妊娠结局包括：胎膜早破、剖宫产、绒毛膜炎、早产、新生儿窒息尚未发现关联。5.孕妇年龄是影响胎膜早破的最重要的因素,当孕妇年龄<30岁,孕期致病菌的差异对胎膜早破并未造成影响。但是,当孕妇年龄>30岁,Megasphaera(巨球菌属),Gardnerella(加德纳菌),Sneathia(纤毛菌属),Prevotella(普氏菌属)可与胎膜早破发生率呈现正相关,是胎膜早破的危险因素。而Lactobacillus spp.(乳酸杆菌属)与胎膜早破发生率呈现负相关,是保护因素。