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木聚糖酶和甘露聚糖酶作为半纤维素酶类,被广泛的应用于食品、饲料、造纸、纺织和医药等领域。本研究对来源于Aspergillus niger的两种木聚糖酶基因进行基因序列优化、拼接合成及表达,研究了重组木聚糖酶的酶学性质,优化了重组木聚糖酶基因工程菌的培养条件,并在此基础上构建木聚糖酶-甘露聚糖酶/甘露聚糖酶-木聚糖酶双功酶,考察了双功酶的酶学性质以及连接肽对酶学性质的影响。主要内容包括以下方面：1.重组木聚糖酶的构建及发酵条件的优化本研究对两条木聚糖酶进行了密码子序列和mRNA稳定性的优化,将优化后的基因分割成相互重叠的短寡核苷酸片段,通过DA-PCR和OE-PCR拼接出全长的基因并在毕赤酵母中实现了表达。纯化后的重组Xyn10和Xyn11的SDS-PAGE电泳显示的条带分别位于33kDa和20kDa,与理论大小一致,且比酶活大小分别为2504U/mg和22253U/mg。重组Xyn10最适温度和pH分别为60℃和5.0,经80-90℃和pH2.2处理后酶活几乎完全丧失。重组Xyn11最适温度和pH为50℃和5.0,该重组酶在pH1.0-12.0下处理2h仍然具有71%以上的酶活力,在90℃处理10min仍有40%的酶活。两种重组酶都对桦木木聚糖的亲和力最大,而对山毛榉木聚糖的催化效率最高,其中重组Xyn11对山毛榉木聚糖的催化效率达到3401.08mL/mg/s。本研究从400株Xyn11重组子中筛选获得一株高表达且遗传稳定的重组菌株Ax11-151,通过单因子和响应面优化后,摇瓶发酵48h的重组Xyn11产量达到2883.86U/mL,是优化前的2.51倍。2.木聚糖酶-甘露聚糖酶和甘露聚糖酶-木聚糖酶融合酶的构建选取性质较好的木聚糖酶基因xyn11和甘露聚糖酶基因man26作为亲本,采用木聚糖酶-甘露聚糖酶和甘露聚糖酶-木聚糖酶两种连接顺序以及(GGGGS)n和(EAAAK)n(2≤n≤4)作为连接肽,通过酶连法和重叠延伸拼接法构建了15种正确连接的融合酶基因以及3种突变基因,15种融合基因在毕赤酵母中都得以成功表达并表现出双功能酶活性。重组融合酶存在高度糖基化现象,经去糖基化酶Endo H处理后重组融合酶呈现的条带与理论值57-58kDa一致。15种融合酶的作用温度和作用pH性质与亲本差异不大。但连接肽为(EAAAK)n(2≤n≤4)的双功酶的热稳定性和酸稳定性均高于连接肽为(GGGGS)n(2≤n≤4)的双功酶。双功酶对底物燕麦木聚糖的亲和力和催化效率(kcat/Km)仅为亲本Xyn11的21%-42%,而融合酶对底物刺槐豆角催化效率则高于亲本Man26。连接肽为3个重复的(GGGGS)/(EAAAK)的双功酶对两种底物的催化效率高于2个和4个重复的(GGGGS)/(EAAAK)的双功酶。N端为木聚糖酶序列的融合双功酶XE3M和XS3M降解丝瓜络的协同效率明显高于N端为甘露聚糖酶的融合双功酶ME3X和MS3X；融合双功酶对70-200目的丝瓜络降解的协同效率最高,XE3M的协同效率最高可达到1.57。综上所述,重组木聚糖酶Xyn11具有较高的发酵酶活和催化效率、较宽的作用温度和pH范围,以及较好的耐热性和耐酸性。在食品、饲料和医药方面具有较好的应用前景。另外,本研究为木聚糖酶-甘露聚糖酶和甘露聚糖酶-木聚糖酶双功酶的构建和连接肽的选择奠定了一定的基础。