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关节软骨属于透明软骨,缺乏神经血管营养,损伤后自身难以修复。组织工程学的出现给关节软骨修复带来了希望。目前组织工程采用的种子细胞多是骨髓间充质干细胞或自体软骨细胞。国内外虽有文献报道外周血中存在间充质干细胞并能够分离及体外培养扩增,但应用外周血来源的间充质干细胞进行软骨修复的研究鲜见报道。透明质酸钠在临床上常用于膝骨性关节炎病人的治疗,有润滑关节、营养软骨的作用,改善病人症状,但是对于它促进关节软骨损伤修复的作用缺乏相关报道。本实验应用兔外周血来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)及可注射材料透明质酸钠(hyaluronate sodium,HS)进行关节软骨修复的研究,观察两者混合注射及单纯应用透明质酸钠对软骨损伤修复的促进作用。目的:尝试将外周血间充质干细胞应用于关节软骨修复研究中,观察外周血MSC与透明质酸钠混合植入关节内后软骨缺损处的修复效果,探讨关节内注射两者混悬液进行软骨修复的可行性;以及观察单纯应用透明质酸钠对软骨修复的促进作用如何。方法:随机选取健康新西兰大白兔共23只(2月龄8只;3月龄15只)。2月龄兔用于动员并分离提取外周血间充质干细胞。首先联合应用干细胞因子(SCF)及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员兔外周血以增加间充质干细胞的数量,之后分离并进行原代及传代细胞培养;传代细胞应用组织学观察及流式细胞仪分析进行鉴定后,取P3代细胞冻存备用。3月龄兔用于软骨修复实验研究。取兔双膝关节制造软骨缺损动物模型,分别于股骨内外髁负重区制造直径4mm、深3mm的软骨缺损区。以透明质酸钠为细胞载体材料,将它与MSC混合制成细胞混悬液备用。从3月龄兔中随机选取10只,以左膝为MSC混悬液治疗组(MSC+HS组),右膝为透明质酸钠对照组(HS组),其余5只作为生理盐水对照组(NS组)。三组均于术后一周开始关节腔内注射(0.5ml),每周一次,连续三次。治疗后12周时处死取材,观察缺损处修复情况、新生组织类型及有无免疫反应。结果1原代培养前3天细胞多处于悬浮状态,贴壁细胞少,而后开始出现并逐渐增多,由短梭形逐渐伸长为长梭形。10天左右克隆开始出现,但大小不一,14～16天时克隆扩大较明显,而后进入较快的增值阶段。25天左右细胞贴壁融合达到80%左右。传代细胞48～72小时后绝大多数细胞贴壁,生长速度较原代有所增快,约16～20天时可再次传代。此后的P2、P3代的纯度变高。细胞原代培养成功率达到73.53%,原代细胞传代后细胞成活率为72.0%。2常规HE染色:细胞为长梭形,少数为多角形,可有突起;细胞核基本为圆形,位于胞体中央,蓝色;胞浆为淡红色。取第三代细胞流式细胞仪分析MSCs的纯度在87%以上。3兔软骨缺损模型构建完成后,前2～3天膝关节轻度肿胀,稍发红,之后肿胀逐渐减退,关节无感染。注射后的兔关节活动良好,无红肿等现象。4治疗后12周时,试验组缺损区基本被修复组织填满,表面较平整光滑,但部分边界尚可见,组织学观察为软骨样组织修复,但浅层纤维化较明显;透明质酸钠对照组修复表面不平整,缺损区内组织填充不完全,表面纤维化明显,修复细胞类似纤维细胞;生理盐水对照组修复组织为纤维组织,填充更加不完全。5外周血MSC组的修复效果明显优于透明质酸钠组(t’=11.81, P<0.01)及生理盐水组(t’=12.60, P<0.01),透明质酸钠组与生理盐水组之间比较统计学上无显著性差异(t’=1.95, P>0.05)。结论1关节腔内注入体外培养扩增的外周血MSC与透明质酸钠的混悬液后能明显提高兔急性关节软骨缺损处修复组织的质量,修复组织为软骨样组织,但其浅层退变较明显。2异体外周血MSC注入关节内后,能够逃避机体免疫系统,避免了排斥反应的发生;此外,短期内滑膜中未见到软骨样组织形成,应用比较安全。3在急性关节软骨缺损修复治疗中,透明质酸钠组与生理盐水组相比无显著性差异,因此单纯注射透明质酸钠对改善兔急性关节软骨缺损处修复组织的质量无明显促进作用。4外周血来源的MSC相比骨髓来源创伤小,获取方便,且在质量和数量上能基本满足软骨修复的需求。