北方5省区致病疫酶抗药性及细菌SR13-2的防病促生机理

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引起马铃薯晚疫病发生的病原菌是致病疫霉(Phytophthorainfestans(Mont.)deBary),属于藻界、卵菌门、卵菌纲、腐霉科、疫霉属(Phytophthora)。在马铃薯原产地及其它主产区,其最初观察到的主要是A1交配型,但随着马铃薯种质资源的迁移以及病菌自身的分化变异或其它因素,在许多马铃薯产区逐渐出现了A2交配型,且自育型和A1A2型也开始增加,表明致病疫霉产生卵孢子的潜在能力已大幅度增加,这使得致病疫霉对外界的环境更加适应,也导致晚疫病更难防治。目前针对晚疫病的防治手段主要依靠化学农药,而在诸多化学农药中甲霜灵的使用最为广泛,效果最为理想。但由于近年来农药的滥用,尤其是甲霜灵的长期过量使用,导致致病疫霉对甲霜灵的抗性越来越强,更加大了对马铃薯晚疫病的有效防治难度。因此,及时监测致病疫霉对甲霜灵的抗性状态以及寻求甲霜灵的替代品已成为保障其马铃薯生产及其产业发展的必要条件。此外,虽然化学农药能够高效快速的防治马铃薯晚疫病,给农民带来较大收益,但给环境带来的污染更不容轻视。所以在筛选防病效果好、毒性小、环境污染轻的农药的同时,加大对有益微生物研究的力度,推进生物制剂代替化学农药的发展,目前已成为受到许多学者关注的重要研究方向之一。
  本实验所研究的SR13-2菌株属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、沙雷氏菌属(Serratia)、深红沙雷氏菌(Serratiarubidaea)。该菌株对致病疫霉菌丝生长有很强的抑制作用,且抑菌作用稳定,在马铃薯离体组织上也表现出很好的预防晚疫病的效果,但对于该菌株后续的研究,比如在种薯和活体植株上的防病效果还未可知,其次对于含有SR13-2的几株拮抗菌的混合菌液在实验中表现出的对马铃薯种薯或幼苗生长有促进作用的现象,是否与SR13-2菌株有关也未可知。
  本实验的主要研究内容:(1)监测北方五省区2017年致病疫霉的抗药性频率及分布。(2)探究致病疫霉对甲霜灵与嘧菌酯之间是否存在交互抗性,评价嘧菌酯是否能够替代甲霜灵用以防治晚疫病。(3)测试SR13-2菌液在马铃薯种薯萌芽期的促生防病效果,并寻找种薯处理的最适浓度。(4)评价SR13-2菌液对马铃薯盆栽植株的促生防病效果,并明确对马铃薯盆栽植株处理的最佳方式。(5)初步探索其促生防病作用机理。
  本实验获得的研究成果如下:
  1、2017年共采集并分离出致病疫霉菌株137株,从中纯化得到致病疫霉82株,经甲霜灵抗药性检测,其中敏感、中抗和高抗菌株分别为7株、59株和16株,分别占检测致病疫霉总菌株的8.5%、72.0%和19.5%,高抗菌株在5省区均有分布,其中辽宁省最高(28.6%),河北省最低(16.7%)。
  2、使用嘧菌酯对部分高抗甲霜灵菌株进行毒力测定,发现其EC50值处于0.0322-0.1122μg/mL之间,平均值为0.0841μg/mL,远远低于敏感评定基线1.0μg/mL。这说明致病疫霉菌株对甲霜灵和嘧菌酯之间不存在交互抗性,嘧菌酯可代替甲霜灵用以防治马铃薯晚疫病。
  3、不同浓度的SR13-2菌液对马铃薯种薯浸种处理后发现,该菌液原液和稀释菌液10-1这2种浓度的菌液对种薯均有不同程度的腐蚀现象,而5×10-1、10-2、2×10-2和4×10-2这4种浓度处理后对种薯具有很强的促生作用,5×10-1倍浓度的SR13-2菌液浸种处理第9天时,芽长为1.8cm、芽粗1.1cm、鲜重0.31g,在所有处理中长势最好。
  4、被SR13-2菌液浸种后的种薯切块,对致病疫霉表现出了很强的抗病能力,通过对不同浓度的浸种效果对比发现5×10-1、10-2和2×10-2这3种浓度下,致病疫霉菌丝体均不能在种薯切块上生长,5×10-1倍浓度的SR13-2菌液浸种效果最好。
  5、不同浓度的SR13-2菌液对马铃薯种薯浸种处理后发现,可溶性糖和蛋白的含量均在第9天时达到其最高值,其中5×10-1倍浓度处理后的种薯中可溶性糖的含量最高,可达106.37mg/g,比对照高出27.9%;10-2倍浓度处理后可溶性蛋白的含量最高,可达14.29mg/g,较对照高出98.7%。呼吸作用相关酶PPO的活性在6天时达到最高,其中5×10-1倍浓度处理后活性最高,比对照高出69.61%;第9天时5×10-1倍浓度处理后AAO的活性最高,较对照高出93.76%。
  6、比较了不同浓度SR13-2菌液处理后马铃薯种薯萌芽期抗性相关酶活的变化,发现POD、SOD和PAL的活性均在第4天时达到其峰值。实验组与对照组中SOD的活性没有明显的差别,而POD和PAL均以5×10-1倍浓度处理后活性最高,其中POD的酶活比对照高出124.02%,而PAL高出65.19%。
  7、经5×10-1倍浓度的SR13-2菌液浸种后,出苗时间与对照相比早了6天,生长出的幼叶表现为更加健康的墨绿色,且蒸腾速率较对照相比提高了1倍。离体叶片也表现出了抗晚疫病的能力。
  8、对马铃薯进行不同处理后,其中浸种、灌根又喷叶的全处理实验组马铃薯盆栽植株长势最好,第60天时株高42.7cm、茎粗1.9cm、叶片数54片、最大叶面积44.58cm2;其次是分别进行浸种或灌根的处理,而喷叶处理的较差;还发现全处理、或浸种、灌根处理后的植株和离体叶片与对照相比,均表现出很强的抗病能力,但喷叶处理效果不太明显。
  9、与浸种、灌根或喷叶的单独处理相比,全处理后幼苗生长期马铃薯叶片中的可溶性糖、可溶性蛋白、总叶绿素的含量和PPO、AAO、POD、PAL的活性均是最高,其中可溶性糖的含量为60.32mg/g,较对照高出41.80%;可溶性蛋白的含量为32.54mg/g,比对照高出86.05%。总叶绿素的含量为3.97g/mg,较对照高出41.28%。PPO、POD和PAL活性分别比对照高出105.54%、303.75%和280.11%,但AAO的活性与对照相比差距不大。
  综上所述,2017年北方5省区致病疫霉高抗甲霜灵菌株在各省区均有分布,且频率较高,嘧菌酯可代替甲霜灵用以防治马铃薯晚疫病;SR13-2菌液浸种后种薯中可溶性糖和蛋白的含量、呼吸作用相关酶PPO和AAO、以及抗性相关酶PAL和POD的活性均显著升高,可能促进了种薯萌芽和幼芽的生长以及提高了预防晚疫病的效果;浸种结合灌根和喷叶的全处理,使苗期叶片中的可溶性糖、蛋白、总叶绿素的含量、抗性相关酶POD、PAL的活性显著增加,促进了出苗、幼苗生长以及对晚疫病的防治。
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