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背景近年来,损伤脑组织的修复一直是国内外研究的重点与难点。研究发现谷氨酸可以促进神经干细胞(NSC:Neural Stem Cells)的增殖与分化,为损伤脑组织的修复提供了新的理论基础和思路。脑梗死及脑组织缺血损伤后会导致细胞凋亡,从而使大量谷氨酸(glutamic acid)外流,引起局部谷氨酸升高。虽然浓度升高的谷氨酸对组织有毒害作用,但是一定浓度的谷氨酸却可以促进NSC的增殖与分化。随着研究的不断深入,我们发现谷氨酸是通过其受体及Shh(sonic hedgehog)信号通路来促进NSC的增殖和分化。和以往的细胞学角度的研究相比,近年来不断进步与完善的分子生物学技术为我们提供新的研究方法和思路。在本文中,我们从分子层面深入地对谷氨酸及其受体及Shh (sonic hedgehog)信号通路介导的NSC的增殖和分化进行了研究。目的体外培养3日龄SD大鼠海马区原代神经干细胞,并使用传代三代以上神经干细胞来筛选目的基因最适浓度,向三代神经干细胞中加入目的基因,上调和沉默Shh基因后观察神经干细胞中谷氨酸刺激下Nesting的表达,Shh信号通路对神经干细胞增殖能力的影响,同时阻断上游谷氨酸NMDA受体后,在谷氨酸刺激下,神经干细胞中Shh、Nestin mRNA及蛋白的表达变化情况及其对神经干细胞相关增殖力的影响。方法1、在大鼠神经干细胞中添加5uM的谷氨酸进行刺激,通过荧光定量PCR及Western blot技术检测大鼠神经干细胞中基因Shh的mRNA及蛋白表达量；2、采用Shh-shRNA质粒转染大鼠神经干细胞,将转染后阳性NSC添加5uM谷氨酸刺激,通过荧光定量PCR及Western blot技术检测大鼠神经干细胞中基因Shh和Nestin的mRNA及蛋白表达量；3、在大鼠神经干细胞中通过谷氨酸受体阻断剂Conantokin-R阻断谷氨酸受体NMDAR1,添加5uM谷氨酸刺激,通过荧光定量PCR及Western blot技术检测大鼠神经干细胞中基因Shh和Nestin的mRNA及蛋白表达量；结果1、因Shh-shRNA质粒上具有绿色荧光蛋白(eGFP)基因,细胞转染24小时在荧光显微镜观察,转染后有少量阳性细胞内有绿色荧光蛋白,被激发细胞呈现绿色荧光。嘌呤霉素筛选48小时大部分未转染Shh-shRNA质粒的细胞死亡,大量存活细胞为成共转染的阳性细胞.2、实时荧光定量PCR检测结果显示,Shh、Nestin检测扩增曲线及熔解曲线均良好,无非特异性扩增。正常培养的神经干细胞Shh、Nestin为参照,5uM谷氨酸组Shh、Nestin表达均明显增加(P<0.05)；Conantokin-R组Shh、Nastin mRNA表达均未见明显增加(P>0.05)；Shh-shRNA组Shh mRNA表达明显受到抑制(P<0.05),Nestin表达未受到明显影响(P>0.05)；NC-shRNA组Shh、Nestin表达均明显增加俨<0.05)。3、蛋白印迹结果表明,相对于正常培养的神经干细胞,5uM谷氨酸组Shh、Nestin蛋白表达均明显增加(P<0.05)；Conantokin-R组Shh、Nestin蛋白表达均未见明显增加(P>0.05);Shh-shRNA组Shh蛋白表达明显受到抑制(P<0.05),Nestin蛋白表达未受到明显影响(P>0.05)；NC-shRNA组Shh、Nestin蛋白表达均明显增加(P<0.05)。结论Shh信号通路及NMDA受体在神经干细胞的增值过程中发挥了重要作用,谷氨酸可以通过NMDAR1来激活Shh信号传导途径,从而刺激NSC的增殖.