TrkB--ASIC3信号参与H2O2诱导的PC12细胞损伤的分子机制研究

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本文从以下两部分进行阐述:
  第一部分:ASIC3参与H2O2诱导的PC12细胞损伤
  目的:探究酸敏感离子通道3(acid-sensing ion channel3,ASIC3)在H2O2引起的PC12细胞损伤中的作用及机制。
  方法:采用随机数字表法,将PC12细胞分为3组:对照组(Con组)加入PBS缓冲液,H2O2组加入200μmol/L的H2O2,AMI+H2O2组在H2O2作用前加入100ymol/L的ASIC3的抑制剂阿米洛利(Amiloride,AMI)预处理1h,各组孵育24h后采用CCK8法检测细胞活力,2,4-二硝基苯肼显色法测定上清液乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)释放率,RT-qPCR法测定ASIC3、原肌球蛋白受体激酶B(tropomyosin receptor kinase B,TrkB)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)的mRNA表达,Hoechst染色和FITC Annexin V/PI双染法观察细胞核形态变化并分析细胞凋亡情况,Western blot法测定ASIC3、TrkB、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(B-cell lymphoma-2related X protein,Bax)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Cleaved caspase-3)蛋白表达。
  结果:与Con组相比,H2O2处理降低细胞活力(P<O.01),使细胞核固缩、碎裂,增加细胞凋亡率和LDH的释放(P<0.01),增加ASIC3、lL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达(P<0.01),降低TrkB mRNA表达(P<0.01),增加ASIC3、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达(P<0.01),降低TrkB、Bcl-2蛋白表达(P<0.01);与H2O2组相比,AMI预处理增加细胞活力(P<0.01),减少致密浓染的细胞,减少细胞凋亡率和LDH的释放(P<0.01),降低IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达(P<0.04),降低Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达(P<0.05),增加Bcl-2蛋白表达(P<0.01),对TrkB蛋白表达无明显影响。
  结论:ASIC3和TrkB参与H2O2诱导的PC12细胞损伤,抑制ASIC3可以减轻炎症与凋亡,但不影响TrkB的表达。
  第二部分:TrkB通过调控ASIC3信号参与H2O2诱导的PC12细胞损伤
  目的:阐明TrkB激动剂7,8-二羟基黄酮(7,8-Dihydroxyflavone,7,8-DHF)通过抑制ASIC3信号减轻H2O2诱导的PC12细胞损伤的分子机制。
  方法:采用随机数字表法,将PC12细胞分为3组:对照组(Con组)加入PBS缓冲液,H2O2组加入200μmol/L的H2O2,7,8-DHF+H2O2组在H2O2作用前加入25μmol/L的7,8-DHF预处理1h,各组细胞孵育24h。CCK8法检测细胞活力,2,4-_硝基苯肼显色法测定上清液LDH释放率,RT-qPCR法检测IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达量,Hoechst染色和FITC Annexin V/PI双染法观察细胞核形态变化并分析细胞凋亡情况,Western blot法检测ASIC3、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3的表达。
  结果:与H2O2组相比,7,8-DHF预处理增加细胞活力(P<0.01),减少致密浓染的凋亡细胞,增加细胞数量,形态接近正常,降低LDH释放(P<0.01),降低IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达(P<0.01),降低细胞内ASIC3、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达(P<0.01),增加Bcl-2蛋白表达(P<0.05)。
  结论:激活TrkB可以减轻H2O2引起的PC12细胞损伤,其机制可能与抑制ASIC3信号,减轻炎症与凋亡有关。
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