喉癌是我国东北地区发病率最高的头颈部恶性肿瘤之一，其中95％以上为喉鳞状细胞癌。通过不断的摸索和实践，目前早期喉癌治疗的有效率及保喉率得到了大幅提高，但是中晚期喉癌5年生存率及保喉率仍无明显的提高，中晚期喉癌患者的生存质量没有得到明显改善。因此，喉癌分子水平的研究、基因的早期诊断、新治疗方法的开展均需要我们对喉癌的发病机制能有更进一步的了解，以此来实现对喉癌患者基因水平的治疗，弥补传统手术和放化疗的不足，从而提高患者的生存质量。　　 miRNA是一类内源性的平均由18-25个核苷酸组成的单链非编码小分子RNA，且被证实广泛存在于真核生物中。miRNA参与着包括发育过程中的细胞增殖分化、细胞凋亡、免疫调控等生理活动在内的基本生命过程。目前研究认为miRNA可以通过完全或不完全互补的方式识别靶mRNA的相应位点，干扰靶基因的翻译，实现转录后调控基因的表达。大量实验研究表明，miRNA与肿瘤细胞的增殖凋亡、迁移和侵袭有关。多种肿瘤组织中miRNA表达谱的改变具有高度的特异性，可以作为特殊的生物学标记用于恶性肿瘤的诊断和鉴别诊断。因此，修复或者抑制miRNA在恶性肿瘤细胞中的表达，有可能重建整个机体的正常生理活动网络体系，为肿瘤的靶向治疗或是开发抗肿瘤治疗的药物提供了潜在价值与应用前景。　　 miR-183是miR-183、miR-182及miR-96家族成员之一，目前其在恶性肿瘤中的作用机制尚未完全研究清楚。以往研究表明，miR-183在多种恶性肿瘤中均呈现表达谱紊乱。本实验研究旨在探讨miR-183在喉鳞癌组织中的表达及其临床意义，研究并证实miR-183对Hep-2细胞系增殖、凋亡、迁移及侵袭等细胞功能等方面的影响，同时寻找并验证miR-183潜在靶基因，探讨miR-183在喉鳞癌的发生发展中所发挥的重要作用。　　 材料与方法　　 1、HLSCC组织标本　　 选取2009-2012年间中国医科大学附属盛京医院耳鼻咽喉科手术切除的50例喉鳞状细胞癌和30例癌旁2cm以上正常喉粘膜组织。全部患者术前均未接受过包括化学和放射治疗在内的任何方式的治疗。所有肿瘤组织及颈廓清术后淋巴结组织均经福尔马林固定石蜡包埋、切片并进行常规HE染色，根据UICC喉癌分类标准和TNM分期标准(2002)，确定肿瘤的组织学分型、分化程度及临床分期。50例喉癌组织标本经病理诊断证实均为喉鳞状细胞癌，其中包括:男性41例;女性9例;年龄36-79岁;声门型喉癌17例，声门上型喉癌33例;分化程度，高分化13例;中分化26例;低分化12例;临床分期，Ⅱ期14例，Ⅲ期18例，Ⅳ期18例;有颈部淋巴结转移31例，无颈部淋巴结转移19例。所有标本离体后马上标记好放入EP管中，并直接置于液氮中低温保存，用于提取miRNA和总蛋白。对相关临床因素信息包括性别、年龄、分化程度、发病位置、淋巴结转移等情况进行整理并登记。　　 2、Realtime PCR　　 提取所有组织标本中总miRNA，设计特异性miR-183茎环引物，以U6为内参照，按扩增条件:95℃30sec1个循环，95℃5sec，63℃退火40个循环进行Realtime PCR反应。每个独立组织样本经过3个复管，2次独立实验。得到的数据用公式2-△△Ct的方法进行计算分析。　　 3、细胞培养　　 将冻存于深度冰箱的Hep-2细胞复苏后，用含10％胎牛血清的RPMI1640于37℃，5％CO2孵箱中培养传代稳定后，进行转染。　　 4、细胞转染　　 消化Hep-2细胞并铺6孔或96孔板，观察孔板内细胞密度已达70％左右进行转染操作;设计miR-183 mimics:5’-UAU GGC ACU GGU AGA AUU CACU-3’，5’-UGA AUU CUA CCA GUG CCA UAUU-3’和 miR-183 inhibitor:5’-AGU GAAUUC UAC CAG UGC CAUA-3’按说明书用Lipo2000做为载体进行Hep-2细胞瞬时转染，建立miR-183过表达及表达抑制状态。5％CO2孵箱中培养6小时后终止转染;将带有FAM标记的转染后Hep-2细胞放在绿色荧光倒置显微镜下计数并拍照，将细胞消化后上流式细胞仪检查转染效率。　　 5、细胞增殖、凋亡的检测　　 收集转染前后Hep-2细胞，通过MTT及Annexin V-FITC/PI方法分别检测细胞的增殖活性和凋亡情况。　　 6、Transwell细胞迁移和侵袭实验　　 计数转染处理后Hep-2细胞约为2×105/ml，每小室加入100ul。上室用无血清RPMI1640培养液补足200ul，下室加入20％胎牛血清的RPMI1640培养液，37℃5％CO2孵箱中培养12小时后取出，0.4％多聚甲醛固定，20min，PBS反复洗三次，用棉签小心刮除基质胶和上室内的细胞，0.1％结晶紫染色，PBS反复清洗后，×10倍镜下选取固定16个视野计数细胞数并拍照，以均数表示侵袭细胞数，进行3次独立实验，计平均数。　　 7、Real time PCR和Western blot方法检测　　 收集转染前后Hep-2细胞，Trizol提取总RNA，蛋白裂解液提取总蛋白，设计PDCD4及MTA1特异性PCR引物，订购PDCD4及MTA1抗体，进行Real time PCR和Western blot方法检测转染前后PDCD4及MTA1的mRNA及蛋白水平变化。　　 8、统计学分析　　 将所有的数据通过SPSS16.0统计软件包进行统计学分析。Real-time PCR中所得数据经过Log2换算，将miRNA-183在喉癌组织及癌旁正常喉粘膜组织间表达水平进行Mann-Whimey U检验（Mann-Whitney U test）分析。将单因素方差分析（one-way ANOVA）用于分析miR-183的表达水平和肿瘤发病位置、分化程度、淋巴结转移等资料间关系的分析。Spearman相关分析(Spearman correlationanalysis)用来分析miR-183的表达水平与分化程度、淋巴结转移的相关性。用mean±SD，p＜0.05为有统计学意义。　　 实验结果　　 1、miR-183在喉鳞状细胞癌及癌旁正常喉粘膜组织中的表达。　　 我们通过real-time PCR对50例喉鳞状细胞癌和30例癌旁正常喉粘膜中miR-183的表达水平进行了检测，以U6为内参照，结果表明50例喉癌组织中miR-183的表达水平较正常喉粘膜中的表达明显上调(p＜0.05)。　　 2、miR-183与临床病理因素的关系。　　 为了明确miR-183在喉鳞状细胞癌的发生及进展过程中发挥的作用，将miR-183在肿瘤组织中的表达水平与喉鳞状细胞癌的临床病理参数如发病年龄、性别、发病位置、分化程度及淋巴结转移等进行单因素方差分析(one-wayANOVA)。结果显示，miR-183的表达与年龄、性别、肿瘤发病位置无关，与分化程度及淋巴结转移有关。进一步Spearman相关分析(Spearman correlationanalysis)显示miR-183与喉鳞状细胞癌的分化程度及颈部淋巴结转移呈正相关。　　 3、miR-183对Hep-2细胞增殖的影响。　　 结果显示，相对于空白对照组，转染后24h，48h，72h，miRNA N.C对照组细胞的生长未受到明显抑制，A值为2.2355±0.50690(p＞0.444)，而miR-183 Inhibitor组细胞的生长在转染后48h后开始出现明显的生长抑制，A值为1.6665±0.17966(p=0.03)，有统计学差异。　　 4、miR-183对Hep-2细胞凋亡的影响。　　 AnnexinV-FITC/P1双染方法检测空白对照组miRNA N.C组细胞的凋亡率分别为4.645％±1.19％、4.500％±0.43％(p=0.887);miR-183 mimics组细胞凋亡率为1.71％±0.26％，与空白对照组和miRNA N.C组细胞的凋亡率比较出现降低，但差异没有统计学意义(P=0.07)。　　 5、miR-183对Hep-2细胞迁移和侵袭的影响。　　 miR-183的迁移实验显示，Hep-2细胞的穿膜细胞数在空白对照组是27.37±1.43个，miRNA N.C对照组没有明显变化为27.47±2.00(p=0.927)，转染了miR-183 mimics组细胞的穿膜细胞数为56.0517±5.35(p＜0.001)，转染了miR-183inhibitor组细胞的穿膜细胞数为12±3.03(p＜0.001)，明显降低。miR-183的侵袭实验显示，Hep-2细胞侵过基质胶的穿膜细胞数在空白对照组是24.55±1.23个，miRNA NC对照组没有明显变化为24.45±2.52，p=0.933，转染了miR-183mimics组细胞侵过基质胶的穿膜细胞数为50.90±5.44(p＜0.001)，转染了miR-183组细胞侵过基质胶的穿膜细胞数为10.26±1.35(p＜0.001)，明显降低。　　 6、miR-183靶基因的预测　　 为了进一步明确miR-183对喉癌细胞凋亡和侵袭的调控作用机制，我们通过网络数据库TargetScan对影响喉癌细胞凋亡和侵袭的潜在靶基因进行了预测。这时我们发现PDCD4和MTA1可能为miR-183的有效现在靶基因。　　 7、miR-183靶基因的确认　　 为了进一步验证预测靶基因PDCD4和MTA1是否为miR-183的有效靶基因，我们用Real-time PCR和Western blotting的方法检测了正常Hep-2细胞中PDCD4和MTA1的mRNA和蛋白的表达。结果显示，在转染了miR-183 mimics细胞中，PDCD4蛋白的表达量明显减少(p＜0.001)但是mRNA的表达量没有明显的变化，而MTA1的mRNA和蛋白的表达量均无明显变化(p＞0.05)。这些结果表明miR-183能够转录后调控PDCD4 mRNA和干扰其翻译，抑制PDCD4的表达。　　 结论：　　 1、miR-183在喉鳞癌组织中呈表达上调，并与喉鳞癌的分化程度、颈部淋巴结转移和临床分期呈正相关，表明miR-183可能做为致癌miRNA，参与了喉鳞癌的发生与发展。　　 2、miR-183能够促进人喉鳞状细胞癌（hep-2细胞系）的细胞增殖，同时能够促进喉鳞癌细胞的迁移和侵袭。　　 3、miR-183对预测靶基因PDCD4具有直接或是间接的转录后调控作用，PDCD4为miR-183有效靶基因之一;而MTA1不是miR-183的有效靶基因。