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CD40为CD40L的受体,是相对分子质量(Mr)为48000的Ⅰ型跨膜糖蛋白,属于神经生长因子受体(NGFR)/肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员。CD40主要表达于B细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞、造血细胞、上皮细胞、血管内皮细胞及一些肿瘤细胞(如急慢性淋巴细胞白血病,霍奇金淋巴瘤,鼻咽癌,乳腺癌等)也有表达。CD40/CD40L是免疫细胞间重要的信号传导通路,在B细胞的活化与增殖分化、抗体产生及同种类型转化中起关键作用,在T细胞活化以及效应性细胞因子的分泌过程中也起重要调节作用。CD40分子介导的信号不仅能对CD40+肿瘤细胞直接发挥作用,还可通过调节适应性和固有免疫系统增强机体对表达CD40分子的肿瘤细胞的杀伤效应。目前国际上已有三株人源化抗人CD40单抗进入临床Ⅲ期,但其存在的副作用和安全性问题仍引起高度关注。本科室以往的研究发现一些肿瘤细胞株和新鲜肿瘤细胞表达CD40突变体( CD40mu )(CAC→CAA,78His→78Gln) (NCBI Assay Id: ss23134804,Reference SNP Id:rs17177493),该突变位点位于CD40胞外段第二个富含半胱氨酸的区域,这一区域是CD40与CD40L相互作用的重要区域。基因转染细胞的构建进一步证实了该突变体与抗体的结合能力与野生型CD40截然不同,CD40mu胞外段一个氨基酸的突变可导致局部结构改变而形成新的抗原表位,该抗原表位为CD40mu所特有,为此,研制特异性抗人CD40mu分子的单克隆抗体,具备重要的研发价值。本文研制的mAb 3E4、6B4与10C5是鼠抗人CD40mu单克隆抗体,完全不同于已报道的抗人CD40单克隆抗体,能识别多种肿瘤细胞株(HO8910,H460等)以及肿瘤新鲜组织表达的CD40分子,其中10C5不识别血管内皮细胞株Eahy926以及一些正常组织表达的CD40分子,显示出独特的应用价值。1.鼠抗人CD40mu单抗的杂交瘤细胞株的制备以突变体基因转染细胞L929/CD40mu为免疫原,免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞融合技术,将反复免疫后的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,以突变体基因转染细胞L929/CD40mu为阳性筛选细胞,以野生型CD40基因转染细胞L929/CD40wt为阴性筛选细胞,通过间接免疫荧光标记法对杂交瘤细胞株进行筛选,经多次克隆化培养,最终获得3株持续、稳定分泌鼠抗人CD40mu单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3E4、6B4和10C5,其重链分别为IgG2b、IgG1、IgG3,轻链为κ链。三株抗体均可用于免疫组织化学分析,3E4和10C5可用于Western-blot检测。杂交瘤细胞株经体外连续传代(40代)培养,液氮冻存半年后复苏,仍生长良好,稳定分泌抗体。2.鼠抗人CD40mu单克隆抗体的体外生物学特性研究运用制备的单抗检测发现,部分恶性B细胞株及上皮性肿瘤细胞株表达CD40mu,其在新鲜肿瘤组织中也有高水平的表达。三株单抗与野生型CD40单抗5C11识别的抗原位点不同,对细胞株的识别谱也不相同。不同于已报道的抗人CD40单克隆抗体,三株单抗能识别多种肿瘤细胞株(HO8910,H460等)以及肿瘤新鲜组织表达的CD40分子,其中10C5不识别血管内皮细胞株Eahy926以及一些正常组织表达的CD40分子。继而采用抗CD40mu单抗对表达CD40mu的人卵巢癌细胞株HO8910的体外实验初步表明,单抗3E4能够促进HO8910细胞的体外生长,单抗10C5能够抑制HO8910细胞的体外生长,并且促使其凋亡。综上所述,本研究成功制备了3株特异性鼠抗人CD40mu单克隆抗体,初步探讨了CD40mu在肿瘤中的表达及其生物学意义,证实了肿瘤细胞表达突变的CD40分子;单抗激发表达相应突变的肿瘤细胞后引起了生物学效应:促进/抑制肿瘤细胞的体外生长,并且诱导其凋亡。三株特异性抗体的获得为深入探讨肿瘤细胞表达CD40mu分子的生物学意义提供了物质基础,也为肿瘤的靶向生物治疗提供了新思路。