羊痘是由羊痘病毒所引起的一种急性、热性、接触性传染病,给养羊业造成了巨大的经济损失。羊痘病毒宿主范围局限,绵羊痘病毒、山羊痘病毒、疙瘩皮肤病毒三个种间几乎不产生交叉感染,但近来羊痘病毒跨种感染的案例时有发生,甚至出现羊痘病毒感染人的报道。研究表明宿主范围因子是痘病毒宿主范围的关键因素,并且影响毒力强弱。根据正痘病毒宿主范围因子的研究结果,ANK基因可能是其宿主范围因子,但实验基础数据不多。羊痘病毒含有5个ANK基因（010、138、140、141.2、145）,为了了解ANK基因对羊痘病毒的宿主范围功能及研发临床应用的新型疫苗,本文选择羊痘病毒ANK基因145进行研究。本研究运用生物信息学分析软件设计合成了沉默ANK基因145的三条si RNA。基于对ANK基因的前期研究结果,本研究筛选羊细胞肿瘤坏死因子（TNF）、γ-干扰素（IFN-γ）、α-干扰素（IFN-α）先天性细胞免疫因子,在NCBI网站查找其序列,用primer3 Plus软件设计了其免疫因子的特异性引物。培养羊睾丸原代细胞至密度达到80%-90%时,接种羊痘病毒TS株,再用lip2000转染si RNA,56 h后收集培养物提取病毒总RNA,反转录获得c DNA,用q PCR的方法检测si RNA干扰后各免疫因子的变化,进行生物统计学软件数据分析。分析山羊痘病毒株（Gene ID:5228378）ANK基因145序列段的抗原性结构,分别筛选设计了其全长和4个截短片段的特异性引物,目的基因通过PCR扩增并与pET-42b载体连接构建,经菌液、双酶切和测序鉴定构建ANK基因145全长及4个抗原结构域片段原核表达载体,对ANK基因145基因构建遗传进化树分析。鉴定阳性质粒转化BL21,不同浓度的IPTG 37℃诱导表达,用SDS-PAGE和Western Blotting法鉴定蛋白的表达,目的蛋白表达后,用镍柱纯化与浓缩管浓缩,获得的抗原蛋白加弗氏佐剂后注射免疫新西兰白兔4次,采集血液获得ANK基因145多克隆抗体,用ELISA和Western blotting测其效价和特异性。结果:对羊痘病毒ANK基因145设计的三条si RNA的干扰效果评价,结果表明三条si RNA干扰效果都极显著。对羊痘病毒TS株ANK基因145经三条si RNA沉默后,TNF、IFN-γ的表达量水平都发生明显程度上调,说明与前人研究结果ANK重复蛋白能够选择性的影响TNF、IFN-γ细胞因子的表达量水平,调控羊睾丸细胞免疫因子的表达信号通路的结论相一致,而IFN-α的表达量水平都下降,推测是ANK蛋白功能联合作用的结果。羊痘病毒通过PCR扩增出了ANK基因145全长1400 bp和4段分段为560 bp,490 bp,370 bp,250 bp的目的基因,经双酶切和测序鉴定成功构建了pET-42b-145、pET-42b-145-1、pET-42b-145-2、pET-42b-145-3、pET-42b-145-4共5个表达载体;通过IPTG诱导表达后,结果用SDS-PAGE检测,结果表明构建的全长ANK基因145表达载体pET42b-145未见明显条带出现,3个分段目的蛋白pET-42b-145-1、pET-42b-145-2、pET-42b-145-4均表达且蛋白大小分别为20 KDa,16 KDa,8 KDa左右,Western Blotting鉴定均正确,经纯化浓缩后获得8 KDa的目的蛋白,免疫家兔获得多可隆抗体,通过ELISA和Western bloting检测多克隆抗体效价为1:64000,抗体具有反应特异性。综上所述,RNA干扰羊痘病毒ANK基因145后对宿主细胞中部分免疫因子TNF、IFN-γ、IFN-α的表达具有调控作用,为后续探究羊痘病毒宿主范围因子宿主范围选择与控制病毒毒力强弱及跨物种传播机理提供参考依据。成功构建了5个ANK基因145表达载体,通过诱导表达获得经镍柱亲和层析法纯化浓缩的目的蛋白,目的蛋白经免疫家兔获得了具有反应性的多克隆抗体,多克隆抗体成功的制备为今后诊断检测羊痘病毒和疫苗研发做了基础奠定。