白血病是严重危害人类健康的造血系统恶性肿瘤,是国内十大高发恶性肿瘤之一。其细胞学特征是造血细胞增殖失控、分化障碍、细胞凋亡受阻,以致大量分化异常的白血病细胞增殖。目前,白血病的治疗仍采用大剂量药物联合化疗,不但费用昂贵,而且副作用甚大,尤其对机体免疫和造血系统损害极大,复发率较高。因此,我们急需寻找一种高效低毒的抗白血病天然药物。人参是我国传统中草药,在肿瘤的治疗方面具有很高的药用价值,S型人参皂苷单体Rh2((s)Rh2)是人参中天然活性成分之一,对卵巢癌、胃癌、肝癌和白血病等多种肿瘤细胞都有增殖抑制、诱导分化和促进凋亡的作用,具有强抗肿瘤活性和低毒性的特点。近来研究表明,组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)的异常表达与血液系统恶性肿瘤的发生和发展有密切关系,组蛋白去乙酰化酶被认为是肿瘤治疗的潜在靶点。在众多组蛋白脱乙酰化酶中HDAC6是比较特别的,因为其既可在细胞核中参与组蛋白的乙酰化修饰,又可在细胞质中参与非组蛋白的乙酰化修饰,并在白血病中高表达,故我们认为抑制HDAC6的异常表达可成为治疗白血病的关键策略之一。目前认为,细胞死亡包括3种类型:即坏死、凋亡和自噬性细胞死亡。自噬的异常与肿瘤的发生发展关系密切,可以从不同生物学行为影响肿瘤的进程,其中有细胞周期、增殖、凋亡、耐药、血管生成及肿瘤的治疗等方面的调控。近年来研究发现,蛋白乙酰化和去乙酰化可以影响细胞自噬体的形成,进而影响肿瘤细胞的增殖和凋亡,这为治疗肿瘤提供新的思路。因此,本实验以人白血病细胞k562和kg1α为实验对象,研究(s)rh2对k562和kg1α细胞增殖、自噬凋亡的影响及可能的分子机制。目的研究人参皂苷单体(s)rh2对人白血病k562和kg1α细胞株增殖、自噬和凋亡的影响,初步从组蛋白乙酰化修饰方面探讨(s)rh2对k562和kg1α细胞中hadcs的影响及hdac6调控自噬凋亡的机制。方法第一部分采用cck-8的方法在人参总皂苷和人参皂苷单体rb1、rg1、re、(r)rg3、(s)rh2中筛选对人白血病k562和kg1α细胞株药效最佳的人参活性成分。采用吖啶橙和mdc染色观察(s)rh2对细胞自噬的影响。用rt-pcr检测(s)rh2对白血病细胞自噬重要基因的表达的影响。用westernblot检测(s)rh2对白血病细胞自噬和凋亡重要蛋白的表达的影响。加入自噬抑制剂后,cck-8检测细胞增殖活力,流式测细胞凋亡,westernblot检测细胞自噬凋亡蛋白的表达。第二部分采用化学比色法比较hat和hdac酶活性。运用westernblot和rt-pcr法检测人参皂苷单体(s)rh2对细胞hdacs表达、组蛋白h3乙酰化和自噬凋亡重要基因蛋白表达的影响。构建hdac6sirna的慢病毒质粒感染人白血病k562和kg1α细胞株,并筛选出稳定表达的sihdac6细胞株。分别用人参皂苷单体(s)rh2处理sihdac6的k562和kg1α细胞株,转染空白质粒的k562和kg1α细胞作为对照。用台盼蓝染色、fcm及hoechst染色检测下调hdac6后(s)rh2对细胞增殖和凋亡的影响;用rt-pcr检测下调hdac6后人参皂苷单体(s)rh2对hdac6、hsp90mrna表达水平的影响;用westernblot检测下调hdac6后(s)rh2对hsp90、beclin-1、激活型caspase-3、lc3a和lc3b蛋白表达的影响。第三部分建立人白血病k562细胞裸鼠异体移植瘤模型,人参皂苷(s)rh2灌胃,对照组用生理盐水灌胃。测量肿瘤直径、体积和计算抑瘤率,检测人参皂苷(s)rh2在体内的抗肿瘤活性;he染色观察细胞凋亡,免疫组化检测hdac6,hsp90和激活型的caspase3蛋白表达水平;化学发光法检测瘤组织内hdac和hat的活性;rt-pcr检测自噬重要基因和hdac6,hsp90的mrna表达水平;westernblot法检测hdac1、hdac2、hdac3、hdac4、hdac5、hdac6的表达变化。结果1.cck-8结果显示:人参皂苷单体(s)rh2对k562和kg1α细胞增殖抑制效果最佳,其抑制作用呈浓度依赖性;2.流式细胞术检测结果显示:(s)rh2(60μmol/l)可诱导k562和kg1α细胞的早期凋亡,差异有统计学意义(p<0.05);westernblot结果显示,bax、caspase-3(激活型)随(s)rh2浓度的增加呈上调趋势;3.吖啶橙和mdc染色结果显示:(s)rh2可引起细胞内的酸性自噬小泡增多,导致细胞自噬水平增高;rt-pcr和western-blot结果显示:(s)rh2组细胞自噬关键分子表达增高;4.hat和hdac酶活性检测结果显示:高浓度的(s)rh2(60μmol/l)能提高k562和kg1α细胞中组蛋白乙酰化酶(hat)的活性和降低组蛋白去乙酰化酶(hdac)的活性;5.westernblot结果显示:随(s)rh2浓度的增加,hdac1、hdac2、hdac6蛋白的表达呈下调趋势,h3蛋白的乙酰化水平呈上调趋势;6.台盼蓝染色结果显示:干扰hdac6基因的表达,能有效抑制k562和kg1α细胞的增殖,并增加k562和kg1α细胞对人参皂苷单体(s)rh2的敏感性;7.fcm和hoechst染色结果显示:干扰hdac6基因的表达,能促进k562和kg1α细胞凋亡,并增强人参皂苷单体(s)rh2对k562和kg1α细胞的促凋亡作用;8.westernblot结果显示:(s)rh2可降低hdac6和hsp90表达,上调自噬的重要蛋白beclin-1、lc3a、lc3b和激活型caspase-3的表达;9.体内实验显示:人参皂苷(s)rh2能抑制k562细胞异体移植瘤的生长,抑制率达53.10%;人参皂苷(s)rh2能明显降低瘤体内hdac的活性和降低hdac1、hdac2、hdac6表达水平;人参皂苷(s)rh2能抑制hsp90的表达,并增加自噬重要基因beclin-1、lc3a和lc3b的表达;组织病理学结果显示人参皂苷(s)rh2可促进肿瘤细胞凋亡。结论1.人参皂苷(s)rh2在低浓度时能有效抑制白血病细胞增殖,且其抑制作用具有浓度和时间依赖性,较人参总皂苷和其他人参单体抑制效果为最好;2.人参皂苷(s)rh2能促使白血病细胞发生自噬,诱导白血病细胞发生凋亡;3.人参皂苷(s)rh2能够抑制hdac的活性,增加hat的活性及降低hdac1、hdac2、hdac6蛋白的表达,从而促使k562和kg1α细胞内组蛋白乙酰化水平增加,这可能与其抑制细胞增殖,诱导细胞自噬凋亡的机制有关联;4.下调HDAC6的表达协同人参皂苷单体(s)Rh2主要通过Hsp90通路来实现对人白血病细胞的抑制增殖,诱导自噬,促进凋亡作用;5.体内实验也证明(s)Rh2能通过HDAC6,Hsp90诱导白血病细胞发生自噬和凋亡。