论文部分内容阅读
β-1,3-葡聚糖酶是一类水解酶，分为外切酶和内切酶，二者相互作用能够高效专一的降解β-1,3-葡聚糖，因此广泛应用于啤酒、饲料和农业等领域中。内切β-1,3-葡聚糖酶由于能够以随机的方式切断β-1,3-糖苷键将多糖降解为低分子量功能性寡糖，比外切酶更具有应用价值。β-1,3-葡寡糖是由葡萄糖单体主要以β-1,3-糖苷键连接而成的低聚寡糖，具有预防龋齿、增强机体免疫力、抗肿瘤和诱导植物抵抗病菌等生理功能，在食品、保健品、医药和农业等领域受到广泛的关注。热凝胶是一种线性水不溶性β-1,3-葡聚糖，具有产量和质量稳定，价格低廉，纯度高等特点，是大规模制备功能性β-1,3-葡寡糖的潜在理想原料。哈茨木霉(Trichodermaharzianum)在发酵过程中生产的内切β-1,3-葡聚糖酶具有较高的水解活性，可用于水解热凝胶制备相应寡糖。β-1,3-葡聚糖酶属于诱导酶，微生物本身产酶量较低；此外作为真菌细胞壁的成分，β-1,3-葡聚糖酶会降解细胞壁导致细胞自溶。如何在保证较大生物量的同时提高内切β-1,3-葡聚糖酶的产量及其占β-1,3-葡聚糖酶的比例是本课题的研究重点。本文以T. harzianum GIM3.442作为出发菌株，对其摇瓶发酵条件优化、上罐发酵过程控制和碳源补加策略、内切β-1,3-葡聚糖酶的部分酶学性质等进行了研究，旨在提高内切β-1,3-葡聚糖酶产量及其在总酶中的比例，为规模化酶法制备寡糖提供理论依据。具体内容如下：1.对T. harzianum的摇瓶发酵条件进行了研究。优化后最适发酵培养基为：茯苓多糖60g·L-1，胰蛋白胨20.0g·L-1，NaNO35.0g·L-1，KH2PO410.0g·L-1，MgSO4·7H2O2.0g·L-1，CaCl20.4g·L-1，Mandels微量元素液1mL；优化后的最适培养条件为：初始pH6.0，接种量8%，装液量100mL·500mL-1，28℃，110r·min-1振荡培养6d。发酵结束后蛋白含量、β-1,3-葡聚糖酶总酶活Etotal和内切β-1,3-葡聚糖酶酶活Eendo分别是优化前的4.1倍、8.7倍和23.0倍；Eendo/Etotal由0.24提高到0.63，效果显著。2.对分批发酵过程中过程参数进行了研究。提出了两阶段pH和搅拌转速控制策略：在发酵前期(0-36h)，控制pH7.0，搅拌转速为100r·min-1；在发酵中后期(36h-168h)，控制pH5.0，搅拌转速为200r·min-1。发酵结束后Etotal和Eendo分别是分批发酵(未控制)的2.5倍和4.2倍。Eendo/Etotal达到了0.71，比分批发酵时(0.43)提高了65.1%。3.对培养基中葡萄糖和茯苓多糖的复合及碳源补加进行了研究。复合后结果表明葡萄糖质量分数为30%时，其阻遏效应较小。通过分析碳源不同补加时间对产酶的影响，提出了脉冲式补加碳源-分批培养策略：在发酵对数前期(24h)和中期(48h)左右分批补加葡萄糖，使菌体迅速生长，在对数中后期(72h)补入较高浓度的茯苓多糖进行分批培养。Etotal、Eendo达到了721.5U·mL-1和466.2U·mL-1，比分批培养分别提高了185.0%和204.7%。4.将发酵得到的粗酶液进行了部分酶学性质研究。结果表明内切β-1,3-葡聚糖酶的最适反应pH和温度分别为为5.5和50℃，在pH4.5-5.5，45℃-55℃范围内酶活力较高，相对酶活力在90%以上；内切β-1,3-葡聚糖酶活性受Ag+、Hg2+抑制比较明显；其次是K+、Al3+和Fe3+；Ca2+、Fe2+、Ba2+对内切β-1,3-葡聚糖酶酶活的影响较小；Mg2+、Mn2+、Cu2+和Zn2+则对内切β-1,3-葡聚糖酶有一定的激活作用；内切β-1,3-葡聚糖酶对热凝胶的最佳水解时间为2.5h，此时寡糖在总糖中的比重最高。