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目的:构建模拟微重力条件下PC12细胞的培养体系,探讨模拟微重力对PC12细胞衰老的影响及相关机制。
方法:用Cytodex-3型微载体作为PC12细胞的贴附载体,旋转细胞培养系统所提供10-2g的微重力环境进行模拟微重力条件下的细胞培养。选取模拟微重力和正常重力条件下培养6h,12 h,24 h,48 h,72 h和96 h的PC12细胞作为研究对象。在倒置显微镜下观察PC12细胞的生长情况;用扫描电镜观察PC12细胞超微结构的变化;流式细胞仪检测PC12细胞各个细胞周期分布的变化:Western blot方法检测PC12细胞p53蛋白的变化,所获得的蛋白条带用Image-ProPlus软件进行分析;生化反应试剂盒检测氧化和抗氧化能力变化;衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)特异性染色对衰老的PC12细胞进行评估。
结果:光镜下模拟微重力培养的PC12细胞表现出类衰老细胞的形态,扫描电子显微镜下观察发现其微绒毛增多。细胞周期分析的结果显示经过模拟微重力培养的PC12细胞其细胞周期阻滞在G1期。在模拟微重力培养96 h细胞周期蛋白p53表达均升高。SA-β-gal染色的结果显示在模拟微重力的作用下,PC12细胞SA-β-gal的活性随着模拟微重力培养时间的延长而逐步升高。PC12细胞内H2O2的水平升高,并且具有时间依赖性。模拟微重力细胞培养上清中的H2O2也相应升高,但是滞后于细胞内的H2O2。模拟微重力培养PC12细胞48 h的上清液也能够诱导PC12细胞出现衰老的变化,但是用NAc预先处理模拟微重力PC12细胞培养上清液以后,该上清液不能够诱导PC12细胞的衰老。模拟微重力条件下培养的PC12细胞,其细胞内SOD,GSH-Px和CAT的水平在12 h稍有升高,于48 h与正常重力培养组没有差别,96 h明显降低。在模拟微重力培养的过程中,加入NAc可以降低PC12细胞H2O2的生成,SA-β-gal染色阳性细胞的比例也随之下降。
结论:(1)成功建立PC12细胞的模拟微重力培养体系;(2)模拟微重力可以引起PC12细胞衰老样的形态变化,G1期细胞周期阻滞和p53的活化:(3)模拟微重力条件下诱导PC12细胞衰老具有时间依赖性;(4)模拟微重力条件下诱导PC12细胞衰老可以通过氧化应激实现。