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背景和目的肺癌是目前是全世界肿瘤性疾病死亡率的主要原因,每年可造成多于150万人死亡。目前多数肺癌患者明确诊断时已是晚期,临床症状不明显、早期诊断困难,组织学亚型不同、对肿瘤生物学特征的认识不足导致了肺癌的预后不良及高死亡率。虽然新的分子靶向治疗对于某些类型的肺癌的疗效表现出非常可观的前景,但目前还没有适用于大规模的肺癌病人的靶向治疗。总体来说,肺癌的总体生存率依然不容乐观,很多患者明确诊断后生存期仅仅短短数月。因此,寻找新型肺癌诊断相关的肿瘤标记物或新的治疗策略对于肺癌的控制显得至关重要。miRNA是一段大约由19到25个核苷酸组成的非编码小RNA,通过对其靶m RNA的翻译抑制或者降解在动植物体内发挥重要的调节作用。miRNA是多细胞生物体内众多基因调控分子的重要组成部分之一,同时很可能影响着许多蛋白编码基因的表达输出。miRNA按照其在肿瘤的发生发展中的调控作用可分为致癌miRNA和抑癌miRNA,调控癌细胞的增殖、侵袭、凋亡及血管生成情况。miRNA的表达模式可能与肺癌亚型中临床病理特征有关,提示了miRNA作为生物标志物在肿瘤起源、组织学类型、侵袭性和化学敏感性等分型中的应用潜力。总的来说,涉及肺癌的miRNA范围广泛,let-7家族、miR-34、miR-200、miR-126等miRNAs在肺癌中的作用已被广泛研究。通过查阅相关文献及搜索miRBase数据库,发现miR-339在甲状腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌等多种肿瘤生长及侵袭中起到负向调控作用。miR-339如何调控肿瘤的生物学行为,其具体作用机制尚未阐明,且miR-339在肺癌尤其是临床肺癌组织中的表达情况亦较少研究。目前多数研究者认为肿瘤的生长必须依靠新生血管的生成来提供其足够的氧气和营养物质,因此以抗肿瘤血管为主的治疗成为肿瘤临床治疗的热点,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)被认为可作用于血管内皮细胞,诱导体内新生血管生成。抑制VEGF的作用也成为了抑制肿瘤生长的临床研究基础。当VEGF与特异性的VEGF受体结合后,会发生一系列的生物效应,能促进血管内皮细胞增殖诱导新血管的生成;增加血管通透性;改变血管内皮细胞的基因及其表达,利于新血管的形成。本研究通过miRNA的靶基因预测数据库对miR-339的靶基因进行预测,对3种靶基因预测数据库所预测的靶基因交集进行功能分析,最终筛选出VEGF作为miR-339的靶基因进行研究。本课题分为三个部分:第一部分通过qRT-PCR及Western blot方法分析41例肺腺癌组织中miR-339和VEGF的表达水平;第二部分采用慢病毒载体技术,建立稳定高表达miR-339的肺腺癌A549细胞株,研究体内外上调miR-339表达对肺腺癌A549细胞增殖、侵袭、化疗敏感性及血管生成的影响;第三部分通过双荧光素酶报告实验及Restore实验进一步研究miR-339对VEGF转录后的调控机制。第一部分41例肺腺癌组织中miR-339和VEGF的表达水平分析方法1.收集41例肺腺癌组织与相应配对的癌旁正常组织标本。2.运用qRT-PCR技术检测41例标本中miR-339及VEGFmRNA的表达水平,Spearman相关分析对二者的相关性进行分析;Western blot方法检测41例标本中VEGF蛋白表达水平。3.分析miR-339与VEGFm RNA在不同年龄、性别、淋巴结转移情况、分化程度、TNM分期病例之间是否存在差异。4.统计学方法:本研究数据应用SPSS 21.0软件进行统计分析,符合正态分布的数据以表示;单因素方差分析用于同时具备正态性及方差齐性数据的多项指标间的比较,LSD-t检验用于多组数据的两两比较;t检验用于两独立样本计量资料的比较,配对t检验用于两配对样本计量资料的比较;Spearman相关分析用于两组数据资料的相关性分析,检验水准α=0.05。结果1.miR-339在肺癌组织中的表达约为癌旁正常组织的1/3,而VEGFm RNA的表达水平是癌旁正常组织的3倍,二者的表达水平之间存在负相关性(r=-0.419,P=0.006)。2.miR-339及VEGFmRNA在不同TNM分期及淋巴结转移情况的肺腺癌组织中表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分上调miR-339表达对肺腺癌A549细胞增殖、侵袭、化疗敏感性及血管生成的影响方法1.制备和包装miR-339及无关序列慢病毒表达载体,感染肺腺癌A549细胞,建立稳定高表达miR-339的肺腺癌A549细胞株,实验分miR-339组,NC组,Blank组。2.qRT-PCR检测三组细胞miR-339及VEGFmRNA表达,Western blot检测VEGF蛋白及侵袭相关蛋白MMP2、MMP9表达。3.CCK-8、克隆形成实验检测三组细胞的增殖能力。4.Transwell小室检测三组细胞的侵袭能力。5.CCK-8检测不同浓度顺铂作用下三组细胞的增殖能力。6.建立裸鼠移植瘤模型,应用小动物活体成像仪检测三组裸鼠瘤体的增殖情况。7.小动物活体成像仪检测顺铂作用下裸鼠瘤体的增殖情况。8.免疫组化技术检测移植瘤标本的微血管密度变化。9.采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析,检验水准α=0.05。结果1.成功制备miR-339及无关序列重组慢病毒载体,二者重组慢病毒滴度分别为1.6×108TU/m L及2.2×108 TU/m L。miR-339在miR-339组表达水平明显高于NC组及Blank组(P<0.05)。2.miR-339组VEGFm RNA表达水平明显低于NC组及Blank组,Westren blot显示miR-339组VEGF、MMP2、MMP9蛋白表达较NC组、Blank组明显降低(P<0.05)。3.CCK-8结果显示,miR-339组细胞的吸光度值在24h,48h,72h较Blank组及NC组明显降低,且随时间延长,其差异呈增大趋势(P<0.05)。4.克隆形成实验显示,miR-339组克隆形成数较NC组及Blank组明显减少(P<0.05)。5.Transwell小室结果显示,miR-339组细胞transwell穿膜细胞数较NC组及Blank组明显减少(P<0.05),Blank组及NC组之间穿膜细胞数无明显差异(P>0.05)。6.CCK-8检测0μg/m L,4μg/m L,8μg/m L,12μg/m L,16μg/m L,20μg/m L浓度顺铂作用24小时的吸光度值,结果显示,三组细胞的细胞活力随顺铂浓度升高而降低(P<0.05);miR-339组细胞在顺铂作用下细胞活力降低程度较NC组及Blank组细胞更大,差异具有统计学意义(P<0.05)。7.小动物活体成像系统检测裸鼠移植瘤体内增殖结果显示,从第2周起,miR-339组裸鼠移植瘤荧光信号较Blank组及NC组均明显降低(P<0.05),且随时间延长,miR-339组瘤体与Blank组及NC组荧光信号差异愈加显著(P<0.05)。8.顺铂作用下miR-339组裸鼠移植瘤荧光信号较Blank组及NC组均明显降低(P<0.05),三组裸鼠移植瘤顺铂组的荧光信号均较无顺铂组降低(P<0.05),其中miR-339组在顺铂作用下荧光信号下降程度较Blank组及NC组更加显著(P<0.05)。9.miR-339组裸鼠移植瘤标本微血管密度较Blank组及NC组相比均明显降低(P<0.05)。第三部分miR-339对VEGF转录后调控机理的研究方法1.运用miRNA的靶基因预测数据库对miR-339的靶基因进行预测。2.构建pmir GLO-Wt(野生型)及pmir GLO-Mt(seed region突变型)荧光素酶双报告基因载体,分组转染A549细胞,双报告基因验证miR-339的靶基因。3.构建不含3’UTR VEGF的pcDNA3.1-VEGF表达载体,分别单独转染、与miR-339mimics共转染A549细胞,Western blot方法检测各组细胞VEGF表达情况,Transwell小室检测各组细胞侵袭能力,restore方法分析miR-339对VEGF的调控机制。4.采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。结果1.通过数据库预测VEGF可能为miRNA的靶基因,二者之间存在互补配对的“seed region”区,成功构建pmir GLO-Wt及pmir GLO-Mt报告基因重组载体,并转染A549细胞。2.双荧光素酶报告实验显示miR-339mimics、pmirGLO-Wt共转染组细胞的荧光素酶活性较miR-339scramble、pmir GLO-Wt共转染组及miR-339mimics、pmir GLO-Mt共转染组明显降低,miR-339可作用于VEGF 3’UTR区并产生负调控作用使其表达降低。3.成功构建不含VEGF 3’UTR的pcDNA3.1-VEGF重组表达载体,Restore实验显示,将不含VEGF 3’UTR的pc DNA3.1-VEGF重组载体转染至A549细胞后,可回复上调miR-339对VEGF蛋白表达的抑制作用及miR-339对A549细胞的侵袭抑制作用。结论1.miR-339在肺腺癌组织中呈低表达,VEGF在肺癌组织中呈高表达,二者之间存在负相关,miR-339及VEGF表达水平在不同淋巴结转移情况及不同TNM分期之间存在差异。2.体外上调miR-339表达可降低肺腺癌A549细胞的增殖及侵袭能力,增加细胞对顺铂的敏感性,动物实验表明上调miR-339表达可抑制裸鼠移植瘤的增殖,增加其对顺铂的敏感性,降低瘤组织微血管密度。3.miR-339通过作用于VEGF的3’UTR区对其表达产生负调控作用。