研究背景:脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）造成感觉、运动和植物神经功能紊乱或丧失,且预后通常不良,最终导致患者瘫痪甚至死亡。SCI患者平均年龄不到40岁,大部分患者此后终生需要瘫痪卧床,随之产生的高昂治疗护理费用为其家庭和社会带来巨大负担。同时我国每年还会新增大量的SCI患者（据统计我国每百万人口中SCI发病率达40人次/年）,因此亟待发展有效的SCI治疗方法,而到目前为止脊髓损伤修复仍是世界级的临床难题。脊髓受损伤后,大量神经细胞在几分钟到几小时内死亡丢失。在原发性损伤之后产生的继发性损伤包括炎症反应、细胞凋亡、血管异常、谷氨酸兴奋毒性、自由基形成和脂质过氧化等,导致神经元细胞和神经胶质细胞的继发性死亡,胶质和纤维瘢痕形成,造成永久性的功能退化。其中,炎症反应被认为是继发性损伤的关键组成部分。大量促炎因子在损伤区释放如肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor,TNF）、白介素1（interleukin-1,IL-1）、IL-6等促炎因子进一步诱导趋化炎症细胞的聚集,加重局部炎症反应。原发性和继发性损伤还会产生大量损伤相关模式分子（damage associated molecular patterns,DAMPs）,被释放到血液和组织液中,直接或间接地参与到各种炎症反应和血栓并发症中。此外,SCI炎症反应期间微环境中的活性氧（reactive oxygen species,ROS）显著增加,协同加重神经细胞死亡、轴索变性和运动功能障碍。近年来,包括细胞移植、纳米药物和生物组织工程学等多种策略应用于SCI的治疗。其中纳米材料能够有效清除SCI后DAMPs和ROS,调控局部微环境变化;生物支架材料能够为SCI修复提供温和的条件。研究目的:基于明胶（gelatin,GL）、透明质酸（hyaluronic acid,HA）天然材料来源的水凝胶体系具有良好的生物相容性,能够填补损伤后的物理缺损,促进SCI后内源性神经干细胞的迁移与成熟,并提供生物活性分子、药物和细胞递送的基质体系。因此构建能够模拟生理脊髓环境状态,同时具有稳定递送活性因子、药物和细胞的水凝胶体系是治疗全横断脊髓损伤病变的基础。SCI的修复依赖于脊髓损伤微环境,因此,为了更有效地促进SCI后神经网络重建和功能恢复,需要改善和重塑损伤后的微环境,使其不仅可以降低神经细胞死亡水平并且促进神经再生。单一清除或调控微环境中的某一因子含量对SCI后诱发的炎症反应仅能起到有限的调控作用,因此,本研究拟构建具有神经保护和组织再生双重功能的氧化铈纳米材料体系,用于改造损伤后的炎症微环境,从而提高脊髓损伤治疗修复效果。利用阳离子高分子修饰的氧化铈纳米粒子（cationic polymer modified-cerium oxide nanoparticles,cCONPs）能够清除微环境中的损伤相关模式分子和活性氧等,降低相关炎症反应水平,发挥神经保护作用。此外,利用该阳离子高分子修饰的氧化铈纳米粒子负载递送并缓慢释放促进轴突生长、神经再生的脑源性神经生长因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）,在调节炎症微环境的同时,更好地促进神经损伤的修复和组织再生。研究方法:1、首先构建优化明胶-透明质酸可见光交联混合水凝胶体系。采用扫描电镜（Scanning electron microscope,SEM）,红外傅里叶光谱分析,溶胀实验对构建的GL/HA水凝胶进行表征。通过将优化后的GL/HA水凝胶原位移植入T9全横断脊髓损伤大鼠模型中观察其治疗效果。分组情况:CON组,GL/HA混合水凝胶比例10/0组,9/1组,8/2组,7/3组。术后第10天、60天两个时间点进行取材,采用免疫荧光染色技术重点观察移植治疗后对内源性神经发生、迁移、成熟和分化,对损伤后炎症反应调控,胶质瘢痕形成的影响,利用Basso,Beattieand Bresnahan（BBB）评分、运动电生理检测和斜板试验对SCI大鼠运动功能恢复进行评估。综合评价GL/HA水凝胶体系治疗完全性SCI的效果,并为后续双功能纳米材料提供稳定的基础材料体系。2、设计并制备同时具有清除ROS和DAMPs以及缓释细胞因子的双功能纳米材料体系。通过水热法合成CONPs,在表面修饰阳离子高分子（PAMAM-G3）获得cCONPs,随后通过物理相互作用方法负载细胞因子BDNF,将纳米颗粒包封于GL/HA水凝胶中得到本项目所述的GL/cCONPs-BDNF双功能纳米水凝胶材料体系。采用动态光散射（Dynamic light scattering,DLS）,透射电镜（Transmission electron telescope,TEM）,SEM对cCONPs纳米颗粒大小、电位进行表征。体外试验,首先采用elisa法检测了不同浓度cCONPs纳米颗粒清除ROS和DAMPs,以及BDNF缓释的能力。其次利用细胞活死染色实验检验了GL/cCONPs体系的生物相容性。随后在H2O2模拟的过氧化应激条件中,测试了GL/cCONPs体系对细胞的保护作用与降低细胞内ROS水平。最后,通过qPCR、IF染色探究了GL/cCONPs体系对模拟损伤条件下对炎症反应的抑制作用。体内实验部分,同样应用T9全横断SCI大鼠模型,分四组进行（CON组,GL组,GL/cCONPs组和GL/cCONPs-BDNF组）。通过术后10天、60天取材评价GL/cCONPs-BDNF双功能水凝胶支架体系治疗SCI疗效。分别采用IF染色、多因子抗体芯片技术重点观察GL/cCONPs-BDNF体系移植治疗后损伤区微环境变化,神经再生、轴突延伸情况,瘢痕形成影响和血管再生作用。另外通过对重要器官脏器H＆E染色评估治疗体系的安全性。最后对SCI大鼠运动功能评价评测运动功能的恢复情况。研究结果:1、构建并优化了可见光交联GL/HA混合水凝胶体系。其具有良好的生物相容性,并通过原位成胶的方式填补脊髓损伤区的缺损。我们发现将HA加入到GL水凝胶后,呈HA浓度依赖性减轻SCI后炎症反应与抑制瘢痕形成。此外,当GL/HA比例为9/1和8/2时能够显著促进内源性神经干细胞的迁移与发生,提高神经分化成熟和轴突再生。通过GL/HA混合水凝胶移植治疗方法,促进了T9全横断脊髓损伤大鼠运动功能恢复。2、制备了直径大小为243.29 nm的高分子阳离子修饰的cCONPs纳米颗粒。体外实验结果显示,GL/cCONPs体系在5 mg/mL浓度下对NSCs、raw 264.7细胞无明显毒性。cCONPs纳米颗粒具有良好的清除ROS、结合游离DAMPs的能力,能够减少H2O2诱导损伤条件下的细胞损害。降低DAMPs模拟诱导的炎症反应。且cCONPs-BDNF纳米颗粒能够稳定长效缓释BDNF因子。在全横断SCI损伤模型中,通过GL/cCONPs-BDNF移植治疗能够促进大鼠运动功能恢复。与CON组对比,GL/cCONPs体系可以通过调节损伤后炎症反应改善微环境;GL/cCONPs-BDNF通过长效缓释BDNF因子,促进了损伤后的内源性神经元的再生、成熟;同时抑制长期瘢痕形成。研究结论:综上所述,我们成功构建并优化了明胶-透明质酸水凝胶体系,并在此基础上构建了同时具有神经保护与促进组织再生修复的双功能纳米氧化铈颗粒水凝胶体系,通过清除损伤区ROS、DAMPs显著降低了损伤区的炎症反应,改善了损伤后的微环境。同时利用双功能材料体系长效释放生长因子的特性,给予损伤区营养支持,促进神经分化、再生与成熟,最终促进SCI损伤后运动动能恢复,为SCI治疗提供了新的思路。