PCR技术在黑木耳交配型因子研究中的应用

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黑木耳(Auricularia auricula)是一种栽培历史悠久,深受消费者欢迎的食用菌,具有重要的药用滋补功能。 采用原生质体单核化技术分别获得黑木耳栽培菌株He-1和Ju-1的单核体H2和J3,H2和J3杂交配对形成双核体H2J3。H2J3经栽培出耳后,获得其子实体,通过单孢分离技术获得F1子代59个单核体。 根据交配型将F1代单核体菌株分成两个群(A1和A2),在每群内各抽出10个菌株分别组成A1和A2两个等基因池。同时根据高等真菌中信息素前体羧端的CAAX模体及A座位同源结构域中保守氨基酸序列设计了176种特异性单引物。PCR扩增结果表明,仅引物XY161可以扩增得到一条仅在A1池中出现的特异标记带XY1611462。将该特异带克隆、测序,分析其序列结构,结果显示该标记极可能位于信息素基因的下游端:利用BLAST程序搜索同源序列,没有比对出同源的DNA序列,但其蛋白质序列比对出同源结构域,表明该标记片段可能编码短链脱氢酶,表现出与糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)和新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)等异宗结合担子菌类似的特征。该结果表明交配型座位内的DNA序列变化较大,但其编码的蛋白质结构类似。 根据裂褶菌STE3信息素受体中的保守氨基酸序列设计的简并引物br1-F和br1-R,可以在亲本菌株H2和24个F1子代单株中扩增得到一条811bp的特异带,其中包括F1代9个H2型单株(占供试菌株的15.3%)和15个J3型菌株(占供试菌株的25.4%)。将在H2型菌株59号和J3型菌株45号中扩增得到的特异带进行克隆和测序,运用BLAST搜索同源序列,其DNA序列比对不出同源序列,但其蛋白质序列可以比对出同源结构域——STE3信息素受体,总共搜索到92个同源序列,e值大小从2e-35到8.1;BLAST搜索结果表明,该信息素受体片段更加类似于四极性担子菌。序列分析发现,该片段可能包含4个内含子。SOSUI程序预测该片段编码的蛋白质是具有5个跨膜结构域的膜蛋白。该信息素受体基因片段在子代中表现了极高的重组率,表明该信息素受体基因因与交配型无关,从而表现为不连锁,该结果与二极性食用菌滑菇(Pholiota nameko)类似。 MIP基因与多种同担子菌(Homobasidiomycete)的A交配型座位紧密连锁,根据MIP蛋白(Mitochondrial intermediate peptidase)设计了6对简并引物。MIP系列引物可以在多种同担子菌中扩增出特异带,而在异担子菌(Heterobasidiomycete)中不能扩增出任何特异带,在黑木耳中运用MIP系列引物也不能扩增出任何特异带,这与黑木耳属于典型的异担子菌完全相符。
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