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目的1 归纳总结宫腔粘连(Intrauterine Adhesion,IUA)疾病的一般临床表现,舌、脉特征;深入挖掘宫腔粘连的证候、证素特点,进一步探寻宫腔粘连的病机及治法。2解析防治宫腔粘连内服方药的药物组成规律及用药思路,为进一步疾病治疗机理的探索提供理论依据。3 在临床研究与方药研究的基础上,选取活血化瘀方进行体外细胞实验研究,验证活血化瘀方防治宫腔粘连的疗效,并对其作用途径进行初步探索。方法1证候、证素研究:采用问卷调查法采集宫腔粘连患者的一般人口学信息及四诊信息;总结宫腔粘连患者的一般临床特征,分析宫腔粘连分级的相关危险因素;在IBM SPSS Statistics22软件中应用频数分析法分析宫腔粘连四诊信息,运用因子分析法对宫腔粘连四诊信息进行降维处理,提取证素,结合专业知识分析宫腔粘连证候、证素特点,进一步探析宫腔粘连的病机及治疗法则。2方药研究:应用计算机检索中国期刊全文数据库,维普中文科技期刊数据库、万方医学网数据库,中国生物医学文献数据库关于中药复方或中药联合西药治疗宫腔粘连的文献,根据纳入及排除标准选择研究所需的中药内服方剂;采用频数分析法及主成分分析法对所纳入的中药方剂的用药规律及思路进行分析。3 实验研究(1)原代细胞培养:分离提取SD大鼠子宫内膜上皮细胞(REEC)进行原代培养;应用免疫细胞化学方法检测细胞角蛋白及波形蛋白表达情况以进行细胞鉴定。(2)含药血清制备:SD大鼠桃红四物汤灌胃,主动脉采血制备含药血清。(3)细菌脂多糖(LPS)诱导REEC发生上皮-间质转化(EMT)实验:通过Western blot法检测上皮细胞标志物E-cadherin及间质细胞标志物Vimentin蛋白表达变化以确定LPS诱导REEC发生上皮-间质转化,并确定最佳诱导时间及剂量。(4)桃红四物汤含药血清对REEC发生EMT的干预作用研究:应用不同浓度的桃红四物汤含药血清作用于LPS诱导的REEC,Western blot法检测E-cadherin,Vimentin的蛋白表达变化。(5)桃红四物汤含药血清抑制REEC发生EMT的作用途径研究:a.MTT法检测桃红四物汤含药血清对 REEC 的增殖影响:b.采用 Western blot 法检测 E-cadherin,Vimentin,α-SMA,FSP-1蛋白表达变化,qRT-PCR法检测E-cadherin,Vimentiin,α-SMA,FSP-1基因表达变化。结果1证候、证素研究:(1)一般情况:229例IUA患者平均年龄为31.51±4.24岁,29-35岁年龄段病例人数所占构成比最大,为53.71%。病程在1年内的88例(38.43%),1年以上141例(61.57%)。IUA患者存在多次宫腔操作病史,以宫腔操作2次及以上为多,占比65.50%。手术类型分别涉及:人工流产,早孕期清宫,中晚孕期清宫,剖宫产,宫腔内节育器取出,宫腔镜下子宫纵膈切除,宫腔镜下子宫内膜息肉切除。造成宫腔粘连的手术类型以妊娠期宫腔手术操作最多,占比93.01%;其中以早孕期清宫占比最高,达54.59%。年龄、病程、宫腔操作次数、手术类型在本研究中与宫腔粘连的ESGE分级无相关性;月经量改变与宫腔粘连ESGE分级呈正相关,即减少的月经量越多,宫腔粘连越重,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)四诊信息分布特点:IUA患者高频率四诊信息为:月经量少,脉弦,舌淡紫,月经夹块,脉沉,月经黯红,苔薄白,经行不畅,脉涩,腰酸。(3)证候分布特点:IUA的常见证候分布为肾虚血瘀证,瘀阻胞宫证,气滞血瘀证,脾肾阳虚证,肝郁气滞证,肝郁化火证。(4)证素分布特点:IUA病位证素涉及胞宫,肾,肝,脾。病性证素为血瘀,气滞,阳虚,气虚,热,寒,血虚,湿。2方药研究:(1)一般情况:根据纳入及排除标准最终入选研究文献37篇。其中对宫腔粘连直接进行治疗性文献4篇,采取宫腔镜粘连分离基础上用药预防再粘连文献33篇;对宫腔粘连的治疗采用辨证论治法文献17篇,专方专治法文献20篇。37篇文献中,共统计出符合要求的中药复方60剂,药味103味,用药总频次628次。(2)高频药物:当归,熟地黄,菟丝子,红花,川芎,赤芍,丹参,桃仁,香附,枸杞子为高频使用药物。(3)性味归经:治疗IUA的药物以温性、平性药物为主,寒性药物次之,凉、热药少见。治疗IUA药物以甘味为主,苦味药及辛味药次之,淡味药占比最少。治疗IUA药物以归肝经药味最多,其次为归肾经药物,归脾经药物,归心经药物。(4)药物种类:治疗IUA药物以补虚药物为主,其中补阳药物及补血药使用最为频繁;其次为活血化瘀药物,清热药及理气药。(5)主成分分析:主成分提取法共提取5个主成分。第1主成分主要和活血化瘀相关;第2主成分主要和补气,补阴相关;第3主成分主要和补血相关;第4主成分主要和补阳相关;第5主成分主要和清热相关。3实验研究:(1)原代细胞培养:SD大鼠子宫内膜上皮原代细胞呈多边形,以铺路石样聚集;免疫细胞化学结果提示,REEC广谱角蛋白染色阳性,胞质呈棕色染色,约有92.95%±3.06%细胞胞质pan-Cytokeratin阳性染色;而vimentin阳性染色为4.86%±1.65%。(2)LPS 诱导 REEC 发生 EMT:与 0μg/ml、1μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、12μg/ml诱导剂量相比较,以2μg/ml LPS诱导时,REEC的E-cadherin蛋白表达最低,Vimentin表达最高,差异有统计学意义(P<0.05);Oh,24h,48h,72h各诱导时间中,以48h LPS刺激组REEC的E-cadherin蛋白表达最低,Vimentin表达最高,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)桃红四物汤含药血清抑制REEC发生EMT:加入中、高浓度的桃红四物汤含药血清后大鼠子宫内膜上皮细胞E-cadherin蛋白表达增加(P<0.05),而低浓度组无明显差异(P>0.05);中、高浓度组组间比较无明显差异(P>0.05)。与对照组相比,中、高浓度组Vimentin蛋白表达均明显下降(P<0.05),低浓度组与对照组比较无统计学意义(P>0.05);中、高浓度组组间比较无明显差异(P>0.05)。(4)桃红四物汤含药血清抑制REEC发生EMT的作用途径:a.桃红四物汤含药血清对REEC细胞增殖影响:与对照组(空白血清组)比较,加入桃红四物汤含药血清培养后并不改变REEC的增殖(P>0.05);桃红四物汤含药血清+LPS组与LPS组比较REEC增殖无明显差异(P>0.05)。b.Westem blot法检测,各组细胞培养48h后,上皮标志物E-cadherin在LPS诱导下表达明显下降,而应用高浓度桃红四物汤含药血清处理后则使E-cadherin的蛋白表达上调(P<0.05);间质细胞标志物Vimentin,α-SMA,FSP-1蛋白表达在LPS诱导下均明显上调(P<0.05),应用高浓度桃红四物汤血清处理后Vimentin,α-SMA,FSP-1蛋白表达受抑制,出现下调(P<0.05)。qRT-PCR法检测,应用高浓度桃红四物汤含药血清处理后抑制了 LPS所致的E-cadherin的mRNA表达下调(P<0.05),降低了间质细胞标志物 Vimentin,α-SMA,FSP-1 的 mRNA 表达(P<0.05)。结论1证候、证素研究:(1)宫腔粘连以29-35岁年龄段人群最为常见,妊娠期宫腔操作是导致宫腔粘连的主要手术类型;月经量减少越多预示着宫腔粘连越严重。(2)肾虚血瘀证为宫腔粘连最常见证型。(3)胞宫是宫腔粘连最常见病位证素;宫腔粘连病性证素虚实夹杂,“血瘀”是最核心的病性证素,反映了宫腔粘连的疾病本质。(4)“活血化瘀”与“补虚”是治疗宫腔粘连的基本大法。2方药研究:(1)中药内服方剂主要应用于预防宫腔粘连分离术后粘连再形成,促进子宫内膜恢复。(2)补虚药及活血化瘀药是防治宫腔粘连中药方剂的最主要药物构成;活血化瘀方药为防治宫腔粘连再形成的关键,补虚方药是促进子宫内膜恢复的根本。3实验研究:LPS可诱导REEC发生上皮-间质转化;活血化瘀方可抑制REEC的上皮-间质转化,抗子宫内膜纤维化作用可能是活血化瘀方防治宫腔粘连的作用途径之一。