酿酒酵母中G4 DNA的结构特征及其对Pif1解旋活性调节的研究

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G4(G-quadruplex)DNA是一类特殊的DNA二级结构,其核心结构是四个鸟苷酸通过氢键形成的G-四分体平面,当两个以上的平面在一价阳离子Na~+或K~+的稳定下,就形成了G4结构。G4结构广泛存在于基因组中,并且在DNA复制、转录、端粒代谢等多种生命活动中发挥着重要的作用。因此,正确的处理G4结构对维持基因组稳定性意义重大。解旋酶是一种分子马达蛋白,它依靠水解ATP获得能量来打开核酸之间的氢键。酿酒酵母解旋酶Pif1(S.cerevisiae Pif1)是一类5’-3’DNA解旋酶,它不仅具有极强的G4解旋能力,而且在抑制端粒酶活性、促进冈崎片段的加工成熟以及核糖体DNA复制等过程中都发挥着重要作用。尽管酵母体内G4 DNA的数量及分布已经通过生物信息学的方法得到,但是其结构特征仍然未知,Pif1对不同G4结构的解旋偏好性也不清楚。本文随机选取了酵母体内的83条可能形成G4结构的序列,利用smFRET(单分子荧光共振能量转移)、CD光谱和FRET熔化等实验手段,系统的探究了酵母体内G4的结构特性及其与Pif1作用的机理,得到以下结论:(1)酵母基因组中能够形成G4结构的序列长度在30-60个碱基之间,超过60个碱基,很难形成G4结构。并且随着G4序列的增长,G4结构的稳定性逐渐降低。(2)酵母中G4 motif序列在体外能够形成各种loop长度的G4结构,最短的loop长度为1个碱基,最长的能达到30个碱基以上。在形成的这些G4结构中,平行结构是主要的构型。(3)Pif1对不同类型的G4具有不同的解旋效率,G4结构的热稳定性、构型以及loop长度等都是影响解旋效率的重要因素。Pif1更容易解开热稳定性差、反平行结构的、长loop G4。(4)Pif1解旋G4的速率影响其解旋下游双链,G4结构既能促进也能抑制Pif1的解旋活性。(5)酵母中的G4结构大都具有较长的loop,并且稳定性较低。因此Pif1能解开酵母体内的大部分G4结构。但是对于那些loop较短,稳定性较强的G4,Pif1很难解开,因此可能需要其它的解旋酶来打开这些G4结构。传统的计算方法一般认为G4 loop长度不超过7个碱基,本实验首次报道了酵母基因组中的G4序列能在体外形成loop长度超过30个碱基的G4,这大大刷新了我们对G4结构的认识。另外,Pif1能解开酵母体内的大部分G4,再次证明了其强大的解旋能力,同时也缩小了对基因组稳定性构成挑战的G4部分,有助于理解Pif1介导的不同G4结构对基因组稳定性的影响。
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