研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种常见的血管系统疾病。在西方发达国家,50%的人口死亡与AS有直接或者间接的关系,AS已成为心血管疾病世界范围内引发人口死亡的最主要原因。AS主要累及大中型血管动脉内膜,病变基础是脂质代谢障碍,主要病理特征是大量脂质沉积、斑块形成和动脉管腔狭窄等。AS是由多种因素共同作用引起的疾病,发病机制十分复杂,确切机制并不明确。血管钙化(vascular calcification)是动脉粥样硬化、高血压、糖尿病、血管损伤、慢性肾病和衰老等病变过程中普遍存在的病理表现。研究表明,90%冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的动脉存在不同程度的钙化,血管钙化程度可能直接与动脉粥样硬化性疾病的血管狭窄程度有关。根据钙化位置的不同,血管钙化可分为血管内膜钙化、血管中膜钙化以及血管外膜钙化。其中血管内膜钙化与血管中膜钙化最受临床关注。前者与动脉粥样硬化斑块形成相关,是斑块早期形成、斑块破裂风险增高的危险因素之一;后者是终末期肾脏病患者和2型糖尿病患者血管损伤的重要病理表现。大量研究显示,AS血管钙化不仅仅是简单的钙磷酸盐晶体的被动沉积,也是一种有机的、主动的、复杂的、由细胞所调控的类成骨过程,包括血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)向成骨细胞表型转换以及羟磷酸盐结晶沉淀。Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨形态发生蛋白 2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)等骨化相关蛋白相互作用、相互影响,共同参与血管钙化成骨样细胞分化的过程。然而,AS血管钙化形成和调控机制尚未完全阐明。碳酸酐酶 1(carbonic anhydrase 1,CA1)是碳酸酐酶家族(carbonic anhydrase,CA)中的一员,能够可逆地催化二氧化碳水化形成碳酸氢根,碳酸氢根不稳定,可以迅速地与钙离子结合形成碳酸钙。我们课题组用蛋白质组学方法对强直性脊柱炎(ankylosing sporidylitis)关节滑膜进行了分析。强直性脊柱炎病理表现是髋关节和脊柱关节炎症、骨增生、关节融合和纤维化。通过与类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)、骨关节炎(osteoarthritis,OA)滑膜组织比较,我们发现CA1在强直性脊柱炎患者的滑膜中特异性高表达。通过构建胶原诱导CA1转基因高表达的小鼠关节炎模型,我们发现CA1过表达小鼠的关节炎发病率和发病程度明显增高,关节处出现明显的红肿、僵直,并且有关节融合和异常钙化的情况出现,说明CA1确实参与了强直性脊柱炎的骨关节异常钙化,并可能通过加速碳酸钙沉积促进关节骨化和融合。另外,我们课题组还研究了CA1与乳腺癌钙化的关系,发现CA1在乳腺癌患者癌组织和血液中高表达,结果导致癌组织钙化,同时也抑制肿瘤细胞凋亡和迁移。以上结果说明,CA1不仅刺激生物钙化过程,也促进病理性钙化的发生发展。其他课题组也逐渐发现CAs可能在AS中发挥重要作用。Oksala等研究发现,CA家族的CA2和CA12在人AS斑块中高表达,可能与晚期动脉粥样硬化中单核细胞来源的破骨样细胞有关,并且可能参与了斑块重塑。Ando等用蛋白质组学检测腹主动脉瘤,在其病变组织斑块中检测到大量CA1自身免疫抗原,表明CA1在粥样斑块形成中发挥重要作用。根据他人对CAs和我们课题组对CA1的研究结果,我们认为CA1可能通过刺激组织钙化在AS过程中发挥作用。醋甲唑胺(methazolamide,MTZ)和乙酰唑胺(acetazolamide,AZ)是两种磺胺类衍生物,临床上用于青光眼的治疗。MTZ和AZ是常见的CA抑制剂。MTZ是AZ的升级版,其对CA的抑制作用比AZ强60%左右,且副反应比AZ少。我们课题组之前的研究显示,体外诱导骨肉瘤Saos-2细胞和小鼠乳腺癌细胞系4T1细胞钙化后,CA1表达量明显升高;加入CA抑制剂AZ后,不仅CA1表达量下降,细胞钙化程度也随之降低。上述研究提示,AZ可以有效地抑制细胞钙化。Pierce和Hall等通过新生小鼠的颅骨体外培养实验等研究发现,CA活性可增加骨吸收过程,CA抑制剂MTZ可以抑制骨的再吸收。Nolan等研究发现MTZ、AZ、乙氧苯噻唑胺、二氯磺胺等CA抑制剂均可抑制佐剂性关节炎大鼠模型的关节钙化,减缓大鼠的关节水肿。他们认为CA抑制剂可以通过抑制骨的吸收来防治慢性炎症。我们课题组的临床研究也发现,MTZ抑制了 CA1的表达和关节融合,对强直性脊柱炎患者取得了良好的治疗效果。以上研究说明CA抑制剂MTZ和AZ可以抑制CA1表达及CA1调节的钙化过程。因此,我们认为CA抑制剂可能通过抑制CA1的表达对AS及其血管钙化过程发挥治疗作用。基于我们的前期研究以及他人的发现,本研究计划探究CA1在AS血管钙化中的作用和机制以及CA抑制剂MTZ对AS的治疗作用。本研究分两部分,第一部分首先检测CA1在人主动脉AS组织中的表达情况,观察CA1表达水平与AS病变的关系。该研究也计划建立ApoE-/-小鼠AS模型,检测CA1在模型小鼠主动脉组织中的表达情况,通过观察CA1的表达与钙盐沉积及AS斑块的关系,进一步探究CA1与AS钙化的相关性。同时,本研究对AS模型小鼠应用CA抑制剂MTZ,观察MTZ对AS斑块形成的影响和对AS的治疗作用。血管平滑肌细胞是血管钙化发生的核心场所,血管平滑肌细胞向成骨细胞表型转化是血管钙化的核心环节,CA1如何调控血管钙化尚不明确。所以本研究第二部分选择血管平滑肌细胞作为实验对象,研究CA1在血管平滑肌细胞钙化中的作用。通过体外诱导大鼠血管平滑肌细胞(rat VSMCs)钙化,观察细胞钙化后CA1的表达情况。同时,应用anti-CA1 siRNA和CA抑制剂AZ处理VSMCs,抑制CA1的表达,分析确定CA1在VSMCs钙化中的作用。同时也通过干扰CA1的表达,观察VSMCs增殖、迁移和凋亡能力的变化情况。第二部分研究的目的是通过体外细胞实验探索CA1对AS血管钙化的作用机制。醋甲唑胺片是一种临床药品,但是没有无菌状态可用于细胞培养实验的MTZ。由于用于细胞培养实验的无菌AZ可商用获得,所以本研究选择MTZ用于第一部分的动物实验,AZ用于第二部分的VSMCs细胞实验。第一部分CA1在AS组织中高表达以及MTZ在AS小鼠模型中的作用研究方法1.为了研究CA1在人主动脉组织中的表达情况,本研究在山东大学附属千佛山医院心外科通过心外科手术收集人主动脉组织标本14例。其中包括对照组人健康主动脉组织标本(心脏移植供体主动脉组织)7例,实验组人主动脉AS组织标本(选择主动脉瘤和主动脉夹层患者作为研究对象,通过病例查询和影像学检测数据筛选出同时具有AS和血管钙化症状的患者,在心外科手术后获取主动脉组织标本作为AS实验组组织标本)7例,分别提取组织蛋白,应用Western blot方法检测人主动脉组织标本中CA1蛋白表达情况。此外,本研究应用人主动脉组织芯片(Alenabio,西安,中国),采用免疫组织化学技术(Immunohistochemistry)检测CA1蛋白在人健康主动脉组织(n=8)和AS组织(n=8)中的表达分布情况。同时采用Von Kossa染色法检测芯片上人主动脉组织钙盐沉积情况,分析钙盐沉积与CA1蛋白表达的关系。2.为了研究CA1对AS钙化是否发挥重要作用,以及CA抑制药物MTZ是否对AS具有治疗作用,本研究按常规通过高脂喂养载脂蛋白E敲基因(ApoE-/-)小鼠建立小鼠AS模型,并在建模第12周对小鼠喂食MTZ(MTZ治疗组),或建模之初喂食高脂饲料的同时喂食MTZ(MTZ预防治疗组)。21周后用试剂盒测定小鼠外周血血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglycerides,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-c)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-c)、一氧化氮(nitric oxide,NO)含量;利用流式细胞术检测血清中炎症因子表达情况;应用Western blot方法和免疫组织化学技术检测CA1在小鼠主动脉组织中的表达情况;通过苏木素-伊红染色(Hematoxylin-Eosin staining,HE)观察小鼠主动脉结构形态的变化情况;采用苏丹Ⅳ染色、油红O染色观察主动脉AS斑块形成情况;应用Von Kossa染色法观察小鼠主动脉组织钙盐沉积情况。结果1.人主动脉组织的Western blot和组织芯片的免疫组织化学结果表明,人主动脉AS组织CA1蛋白表达明显高于人健康主动脉组织;Von Kossa染色结果显示,人主动脉AS组织有大量钙盐沉积,且钙盐沉积部位CA1也高表达,说明CA1可能与AS钙化过程密切相关。2.高脂喂养ApoE-/-小鼠建立小鼠AS模型。小鼠喂食21周高脂饮食后,与正常对照组相比,AS模型组小鼠血清TC、TG和LDL-c含量显著升高,同时HDL-c和NO含量明显减少;与AS模型组相比,MTZ治疗组血清TC、TG和LDL-c水平显著降低,HDL-c和NO水平明显增高;与AS模型组相比,MTZ预防治疗组小鼠血清TC、TG和LDL-c水平减低,HDL-c和NO水平明显增高;与MTZ治疗组相比,MTZ预防治疗组小鼠血清TC、TG和LDL-c水平降低,但TC、TG差异无统计学意义,LDL-c差异有统计学意义,HDL-c水平增高,但没有统计学差异。与AS模型组相比,MTZ治疗组和MTZ预防治疗组小鼠血清中IL-6、IFN-γ、GM-CSF、TNF-α、CXCL1和MCP-1浓度都明显下降。以上结果表明,MTZ在AS小鼠模型中有显著的治疗作用,MTZ可以减少血清炎症因子 IL-6、IFN-γ、GM-CSF、TNF-α、CXCL1 和 MCP-1 的产生。3.ApoE-/-小鼠喂食21周高脂饮食后,HE染色结果发现AS模型组小鼠主动脉出现大量AS斑块,大量泡沫细胞和胆固醇结晶堆积其中,平滑肌层松弛,结构紊乱,炎性细胞聚集,内膜增厚并凸向血管腔,管腔狭窄明显,表明造模成功。与AS模型组相比,MTZ治疗组和MTZ预防治疗组小鼠主动脉AS斑块明显减少,泡沫细胞和胆固醇堆积减少,平滑肌层较规整,炎性细胞聚集度下降,管腔增大,MTZ预防治疗组AS程度最弱。苏丹Ⅳ染色和油红O染色结果表明,与正常对照组相比,AS模型组小鼠主动脉AS斑块面积明显增大;与AS模型组相比,MTZ治疗组小鼠主动脉斑块面积减小,MTZ预防治疗组面积最小。Von Kossa染色结果显示,AS模型组小鼠主动脉有大量黑褐色钙盐沉积,与AS模型组相比,MTZ治疗组和MTZ预防治疗组小鼠主动脉几乎看不见明显的钙盐沉积。免疫组化结果显示CA1高表达区域主要出现在钙盐沉积部位。Western blot和免疫组织化学结果同时证明,CA1在小鼠主动脉AS组织中高表达,MTZ可以抑制CA1的表达。以上结果说明CA1及其调节的钙化影响小鼠AS的进程,MTZ处理后可使小鼠AS程度明显减弱。结论1.在人和小鼠主动脉AS组织中,CA1蛋白表达水平显著升高,且CA1高表达区域与钙盐沉积存在共定位,显示了高表达的CA1可能促进AS血管钙化的发生。2.在小鼠AS模型中,CA抑制剂MTZ降低血脂TC、TG和LDL-c的含量,升高HDL-c和NO含量,降低小鼠血清炎症因子IL-6、IFN-y、GM-CSF、TNF-α、CXCL1和MCP-1的产生,减少AS斑块的形成,证明了 MTZ有治疗AS的作用。3.在小鼠AS模型中,高表达的CA1与AS血管钙化有关,MTZ抑制AS血管钙化,而CA1是MTZ的作用靶点,说明MTZ可能通过抑制CA1的表达及其调节的钙化对AS发挥治疗作用。第二部分CA1在血管平滑肌细胞钙化中的作用及其机制研究方法1.为了研究CA1与血管平滑肌细胞(VSMC)钙化之间的关系,本研究体外培养大鼠血管平滑肌细胞(rat VSMCs),用β-磷酸甘油(β-glycerophosphate,β-GP)诱导细胞钙化,同时也用CA抑制剂乙酰唑胺(acetazolamide,AZ)处理细胞,观察细胞钙化是否被抑制。本研究用茜素红染色法观察细胞钙化结节的形成情况,十六烷基氯化吡啶定量分析细胞钙化程度。为了研究细胞骨化情况,本研究应用Real-time PCR方法检测骨化相关基因runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨形态发生蛋白 2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)的表达水平。同时本研究应用Western blot方法检测细胞钙化前后CA1表达量的变化,应用流式细胞术检测AZ处理的VSMCs细胞培养液炎症因子的表达情况。2.为了检测CA1表达对VSMCs细胞增殖、迁移和凋亡能力的影响,本研究在 VSMCs 中分别瞬时转染 Allstars siRNA 和 anti-CA1 siRNA,用 Western blot方法检测CA1蛋白在VSMCs中的干扰效率。本研究通过Cell Counting Kit-8实验、Transwell实验和流式细胞术细胞凋亡实验,观察分析干扰CA1表达对细胞增殖、迁移和凋亡能力的影响。3.为了进一步研究CA1表达对VSMCs钙化和炎症因子表达水平的影响,本研究用β-GP诱导VSMCs钙化的同时,加入anti-CA1 siRNA进行体外培养。通过Western blot方法检测转染anti-CA1 siRNA后VSMCs的CA1蛋白表达情况;应用茜素红染色法观察转染anti-CA1 siRNA后钙化结节的形成情况;用十六烷基氯化吡啶定量分析转染anti-CA1 siRNA后细胞钙化程度;采用Real-time PCR方法检测转染anti-CA1 siRNA后骨化相关基因Runx2、BMP2和ALP mRNA表达情况;使用流式细胞术检测转染anti-CA1 siRNA后VSMCs细胞培养液炎症因子的表达情况。结果1.VSMCs经过β-GP钙化诱导后,茜素红染色检测到大量的钙化结节。Western blot和Real-time PCR结果证明,细胞钙化后CA1及骨化相关基因Runx2、BMP2和ALP表达明显升高。细胞经AZ处理后,钙化结节明显减少,CA1表达量同时减少,骨化标志基因表达也明显下降。以上结果说明,CA1与VSMCs钙化密切相关,抑制CA1的表达可以抑制VSMCs的钙化、骨化过程。流式细胞术结果显示,AZ处理后细胞培养液炎症因子IL-6、IFN-γ、GM-CSF和TNF-α表达水平明显降低,说明CA1可能刺激VSMCs中炎症因子IL-6、IFN-γ、GM-CSF和TNF-α的表达。2.Cell Counting Kit-8、Transwell实验和细胞凋亡实验结果证明,小分子RNA干扰CA1的表达后抑制了 VSMCs的细胞增殖和迁移能力,促进细胞凋亡能力。以上结果说明CA1可以刺激VSMCs细胞增殖、迁移,抑制细胞凋亡。3.β-GP诱导VSMCs钙化,干扰CA1表达可以显著减少钙化结节的产生。Western blot和Real-time PCR结果表明,干扰CA1的表达,骨化相关基因Runx2、BMP2和ALP表达也随之降低,说明CA1的表达对VSMCs钙化有调节作用。流式细胞术结果显示,干扰CA1的表达后细胞培养液炎症因子IL-6、IFN-γ、GM-CSF和TNF-α表达水平明显降低,说明CA1可能通过增加炎症因子IL-6、IFN-γ、GM-CSF和TNF-α的表达刺激VSMCs钙化。结论1.β-GP诱导VSMCs钙化,细胞钙化后CA1的表达量明显增高。CA抑制剂AZ和anti-CA1 siRNA的应用可以抑制CA1的表达,同时抑制VSMCs细胞钙化,说明CA1表达刺激VSMCs钙化。2.VSMCs钙化模型中,CA抑制剂AZ和anti-CA1 siRNA的应用可以抑制VSMCs细胞培养液中炎症因子IL-6、IFN-γ、GM-CSF和TNF-α表达,说明CA1可能通过增加炎症因子IL-6、IFN-γ、GM-CSF和TNF-α的表达刺激VSMCs钙化。3.通过Cell Counting Kit-8实验、Transwell实验和细胞凋亡实验,发现CA1可能刺激VSMCs的细胞增殖和迁移、抑制细胞凋亡。第一部分和第二部分结果揭示,CA1在人主动脉AS组织和AS模型小鼠的主动脉组织中高表达,高表达的CA1刺激AS血管钙化过程。醋甲唑胺可能通过抑制CA1表达及其所调控的钙化过程对AS发挥治疗作用。抑制CA1调节的钙化可能是治疗动脉粥样硬化的关键点。醋甲唑胺具有潜在的治疗动脉粥样硬化的作用。